王航，黃浩，蔡克銀，丁世芳

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430070；，2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；3.深圳市合一康生物科技股份有限公司臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 513000)

·論 著·

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及功能鑒定

王航1，2，黃浩3，蔡克銀2，丁世芳1

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430070；，2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院干部病房二科，湖北 武漢 430070；3.深圳市合一康生物科技股份有限公司臨床醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 513000)

目的 構(gòu)建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，并驗(yàn)證其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的影響。方法依照shRNA設(shè)計(jì)原則，合成對(duì)應(yīng)的shRNA序列，將其克隆到PHBLV載體中，使用三載體系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝，收集制備成功的病毒，并用熒光顯微鏡法測(cè)定病毒滴度，使用病毒感染EPC后，測(cè)定各組細(xì)胞中S1PR3蛋白表達(dá)情況，選擇合適的病毒感染EPC后，測(cè)定其對(duì)EPC遷移能力的影響。結(jié)果成功將shRNA序列克隆到慢病毒表達(dá)載體PHBLV-U6-RFP，表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后48 h就可以看到細(xì)胞中成功表達(dá)紅色熒光。收集培養(yǎng)成功病毒感染小鼠EPC，可以不同程度干擾細(xì)胞中S1PR3蛋白表達(dá)，S1PR3蛋白表達(dá)受到抑制后，EPC的遷移能力明顯減弱。結(jié)論我們成功構(gòu)建了可以有效干擾S1PR3表達(dá)的慢病毒載體，并初步觀察了其對(duì)EPC細(xì)胞的遷移能力的影響，為后續(xù)進(jìn)一步調(diào)控S1PR3相關(guān)的細(xì)胞功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

慢病毒；1-磷酸鞘氨醇受體3；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞遷移

成年人體內(nèi)血管結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，生理情況下，僅在傷口愈合、組織再生或女性月經(jīng)期出現(xiàn)新生血管形成，而病理情況下，比如腫瘤、心血管損傷后修復(fù)時(shí)會(huì)經(jīng)歷較長(zhǎng)期的血管新生過(guò)程[1]，1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate，S1P)及其受體信號(hào)通路在其中有重要作用。我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)：S1P可以通過(guò)其3型受體(S1PR3)增強(qiáng)內(nèi)皮組細(xì)胞(Endothelial precursor cells，EPCs)的遷移、血管生成能力[2]，并成功構(gòu)建了高表達(dá)S1PR3的慢病毒載體[3]，為進(jìn)一步研究S1PR3信號(hào)通路的作用模式，我們?cè)O(shè)計(jì)并制備了靶向S1PR3基因的特異性小發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，shRNA)，構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體，用于后續(xù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 載體PHBLV-U6-RFP、轉(zhuǎn)染用LipofiterTM購(gòu)自上海漢恒生物，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、磷酸鹽緩沖液(PBS)、大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶、DNAladder購(gòu)自加拿大Fermentas公司，質(zhì)粒DNA小，大量抽提試劑盒為北京康為世紀(jì)公司產(chǎn)品，凝膠回收試劑盒為美國(guó)Axygen公司產(chǎn)品，瓊脂糖、瓊脂粉為上海生工生物公司產(chǎn)品，包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC。

1.2 靶向S1PR3的干擾序列和引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)3條siRNA靶點(diǎn)序列及3對(duì)shRNA序列引物，所設(shè)計(jì)的siRNA序列針對(duì)靶基因的ORF區(qū)域，GC含量為30%～50%，并在目的片段上下游添加酶切位點(diǎn)BamHⅠ和EcoRⅠ。引物由上海銳賽生物科技公司合成，見(jiàn)表1。

表1 靶向S1PR3的siRNA序列和shRNA引物序列

1.3 慢病毒的構(gòu)建 依照shRNA設(shè)計(jì)原則，合成對(duì)應(yīng)的shRNA序列。PCR退火獲得目的片段shRNA，具體條件：95℃，10 min；75℃，10 min；55℃，10 min；35℃，10 min；15℃，10 min；處理好的目的片段shRNA通過(guò)T4連接酶將其與BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的載體pHBLV-U6-RFP連接，4℃過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取轉(zhuǎn)化子，使用pHBLV載體通用引物，PCR鑒定。陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)過(guò)上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序確認(rèn)。

1.4 慢病毒的包裝 慢病毒包裝使用三載體系統(tǒng)，制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及輔助包裝原件載體質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h和72 h后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液，0.45μm濾器(Millpore公司)過(guò)濾，通過(guò)超離心濃縮病毒，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。

1.5 慢病毒的滴度測(cè)定 熒光顯微鏡觀察法：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋為1×104/mL，接種于96孔板中，100μL每孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備6個(gè)孔，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天，收集制備好的病毒濃縮液，10倍倍比稀釋(10～3.3×10-2)，將稀釋好的病毒加入對(duì)應(yīng)的96孔中。轉(zhuǎn)染后72 h，可見(jiàn)細(xì)胞中有紅色熒光，第五天，在顯微鏡下觀察結(jié)果，RFP熒光細(xì)胞在10%～30%的孔計(jì)算病毒滴度。滴度(PFU/mL)=細(xì)胞數(shù)×百分比×MOI(1)×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.6 慢病毒對(duì)EPC細(xì)胞表達(dá)S1PR3蛋白表達(dá)水平的影響 按照我們既往方法制備小鼠脾源性EPC[4]，無(wú)菌條件下，取出小鼠脾臟，充分剪碎后，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，密度梯度離心法分離，獲取小鼠單核細(xì)胞，稀釋為按4×106/mL后接種于經(jīng)過(guò)纖連蛋白包被后的細(xì)胞培養(yǎng)板，加入DMEM/F-12培養(yǎng)液(添加20%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、VEGF 10 ng/mL、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)；48 h后PBS洗滌除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液、傳代。選擇細(xì)胞融合度達(dá)50%的細(xì)胞，分別加入1μL目的或?qū)φ詹《疽?，同時(shí)加入終濃度為8μg/mL的Polybrene促進(jìn)感染。收集培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，空白組細(xì)胞，PBS沖洗后收集、重懸，冰浴15 min，加入25μLNP-40，振蕩10 s；離心15 min(14 000×g)，收集離心后上清，用BAC蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒定量，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。?2%SDS-PAGE電泳(90 V，50 min；110 V，2 h)，半干式電轉(zhuǎn)移(1 mA/cm2，1 h)，一抗?jié)舛龋嚎剐∈骃1PR3多抗(1:200)，抗β-actin單抗(1:1 000)，4℃過(guò)夜；二抗(1:4 000)，37℃，2 h；ECL顯色，X片曝光，洗片。

1.7 轉(zhuǎn)染后EPC細(xì)胞遷移能力的影響 shRNA對(duì)EPCs遷移能力的影響：選擇干擾效果較佳，對(duì)細(xì)胞損傷較小的shRNA-2作為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照病毒感染正常EPCs為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后的EPCs繼續(xù)培養(yǎng)兩周，并加入終濃度分別為10 ng/mL的S1P，共同培養(yǎng)48 h后將EPCs分別重懸，按2×105/孔懸浮于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)液，加入Transwell小室(8.0 μm)，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，棄去小室里的培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗兩次，無(wú)水乙醇固定10 s，PBS漂洗兩次并用棉簽輕柔地擦掉濾膜表面未遷移的細(xì)胞，PBS漂洗1次，1%結(jié)晶紫染色3 min，PBS漂洗3次，隨機(jī)選擇6個(gè)顯微鏡視野(×200)計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 重組成功的PHBLV-RFP-S1PR3測(cè)序結(jié)果 將PCR陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)DNA序列相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(見(jiàn)圖1～圖3)。

2.2 靶向S1PR3的shRNA慢病毒滴度測(cè)定 倍比稀釋后依照顯微鏡觀察結(jié)果測(cè)定慢病毒滴度。結(jié)果：對(duì)照病毒滴度為2×108PFU/mL(見(jiàn)圖4)，S1PR3 shRNA1滴度為1×108PFU/mL(見(jiàn)圖5)，S1PR3 shRNA2滴度為1×108PFU/mL(見(jiàn)圖6)，S1PR3 shRNA3滴度為2×108PFU/mL(見(jiàn)圖7)。

2.3 shRNA慢病毒感染EPC后，各組細(xì)胞S1PR3蛋白表達(dá)情況 使用shRNA慢病毒感染EPC后，shRNA1、2、3均可以不同程度的抑制EPC中S1PR3蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖8)，但是shRNA1、3對(duì)細(xì)胞損傷較大，選擇shRNA-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 慢病毒感染后EPC的遷移能力改變 使用干擾效果較佳，對(duì)細(xì)胞損傷較小的shRNA-2作為實(shí)驗(yàn)組感染EPC后，實(shí)驗(yàn)組EPC對(duì)S1P誘導(dǎo)后遷移能力明顯下降(見(jiàn)圖9)。

圖1 重組質(zhì)粒PHBLV-RFP-S1PR3-1測(cè)序結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒PHBLV-RFP-S1PR3-2測(cè)序結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒PHBLV-RFP-S1PR3-3測(cè)序結(jié)果

圖4 對(duì)照組病毒滴度測(cè)定：選取0.033 μL病毒孔(×200)

圖5 重組S1PR3 shRNA1滴度測(cè)定(×200)

圖6 重組S1PR3 shRNA2滴度測(cè)定(×200)

圖7 重組S1PR3 shRNA3滴度測(cè)定(×200)

圖8 重組病毒感染EPC后S1PR3蛋白表達(dá)情況

圖9 重組病毒感染EPC后遷移能力改變(×200)

3 討 論

EPC是一種特殊類(lèi)型的骨髓祖細(xì)胞，包括了從血管母細(xì)胞到成熟ECs之間多個(gè)階段的細(xì)胞，它能夠進(jìn)入血液循環(huán)，一定條件下可以增殖并分化為ECs，但并未表達(dá)成熟血管ECs表型。生理情況下，早期EPCs主要參修復(fù)血管內(nèi)皮，而晚期EPCs增殖能力明顯增強(qiáng)，在血管生成中發(fā)揮重要作用[5]。既往的許多基礎(chǔ)和臨床研究已經(jīng)證實(shí)EPCs可以自主遷移至血管損傷的部位、分化為ECs，進(jìn)而修復(fù)受損傷的內(nèi)皮[6]。然而，病理情況下，比如PCI術(shù)后、腫瘤患者，體內(nèi)EPC數(shù)量和功能的混亂，既是造成損傷難以痊愈，甚至是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，因此，對(duì)于EPC功能的調(diào)控研究一直是臨床的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[7-8]。

由于EPCs體內(nèi)受到多種因素影響，目前調(diào)控EPCs生物學(xué)功能的具體分子機(jī)制和參與血管損傷后修復(fù)的機(jī)制尚未闡明[9]。深入研究EPCs增殖、遷移等生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)理，找到影響EPCs增殖、遷移的關(guān)鍵分子，或者促進(jìn)EPCs向損傷血管優(yōu)勢(shì)分布的措施，對(duì)血管損傷后良性再生修復(fù)、甚至抗腫瘤治療都具有重要意義。

S1P是鞘磷脂代謝的中間產(chǎn)物之一，廣泛存在于血液和多種細(xì)胞中，既可以作為第二信使傳遞多種生物學(xué)信號(hào)，又可以同細(xì)胞表面的多種特異性受體(S1PR1-5)結(jié)合，發(fā)揮作用[10]。血管損傷的病理過(guò)程中，S1PR3參與調(diào)節(jié)AS過(guò)程中損傷部位中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集[11]，促進(jìn)小鼠胚胎纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[12]。

前期研究中，我們制備了過(guò)表達(dá)S1PR3的EPC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPC的增殖、遷移、血管生成等能力明顯增強(qiáng)，而本次實(shí)驗(yàn)中，我們使用構(gòu)建好的shRNA慢病毒抑制了EPC內(nèi)的S1PR3表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同樣給予S1P刺激后，低表達(dá)S1PR3的EPC遷移能力也被明顯抑制了，說(shuō)明EPC對(duì)于S1P誘導(dǎo)后的遷移能力，很大程度上同EPC上S1PR3的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)也表明我們的靶向S1PR3基因的慢病毒構(gòu)建成功。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，多種基因工程載體被用于臨床上信號(hào)通路的研究，慢病毒的宿主細(xì)胞廣泛，細(xì)胞毒性小，又可以整合到宿主基因組中，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，因此，本實(shí)驗(yàn)也選用了慢病毒載體構(gòu)建shRNA來(lái)干擾S1PR3基因的表達(dá)。

總之，筆者構(gòu)建了可以有效干擾S1PR3表達(dá)的慢病毒載體，并初步觀察了其對(duì)EPC細(xì)胞的遷移能力的影響，為更深入研究S1PR3基因?qū)PC生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。

[1]Paauwe M,Heijkants RC,Oudt CH et al.Endoglin targeting inhibits tumor angiogenesis and metastatic spread in breast cancer[J].Oncogene,2016,25.[Epub ahead of print]

[2]Wang H,Cai KY,Li W,et al.Sphingosine-1-phosphate induces the migration and angiogenesis of epcs through the Akt signaling pathway via sphingosine-1-phosphate receptor 3/platelet-derived growth factor receptor-β[J].Cell Mol Biol Lett,2015,20(4):597-611.

[3]王航,蔡克銀,黃浩.小鼠S1PR3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].海南醫(yī)學(xué),2015,18(26):2653-2656

[4]Wang H,Yin Y,Li W,et al.Over-expression of PDGFR-β promotes PDGF-induced proliferation,migration,and angiogenesis of EPCs through PI3K/Akt signaling pathway[J].PLoS One,2012,7(2): e30503.

[5]王航,黃浩,尹揚(yáng)光,等.過(guò)表達(dá)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β的小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞有助于損傷后血管的再內(nèi)皮化[J].中華心血管病雜志, 2014,42(3):214-218.

[6]Williams PA,Silva EA.The role of synthetic extracellular matrices in endothelial progenitor cell homing for treatment of vascular disease [J].Ann Biomed Eng,2015,43(10):2301-2313.

[7]Pezzoli G,Cavanna F,Cassani E,et al.Endothelial progenitor cells: Cardiovascular protection in Parkinson's disease?[J].Int J Cardiol, 2015,197:200-202.

[8]Kim J,Kim M,Jeong Y,et al.BMP9 induces cord blood-derived endothelial progenitor cell differentiation and ischemic neovascularization via ALK1[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2015,35(9): 2020-2031.

[9]de la Puente P,Muz B,Azab F,et al.Cell trafficking of endothelial progenitor cells in tumor progression[J].Clin Cancer Res,2013,19 (13):3360-3368.

[10]Ramos-Perez WD,Fang V,Escalante-Alcalde D,et al.A map of the distribution of sphingosine 1-phosphate in the spleen[J].Nat Immunol,2015,16(12):1245-1252.

[11]Keul P,Lucke S,von Wnuck Lipinski K.Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes recruitment of monocyte/macrophages in inflammation and atherosclerosis[J].Circ Res,2011,108(3):314-323.

[12]Ishii I,Ye X,Friedman B,et al.Marked perinatal lethality and cellu-Lar signaling deficits in mice null for the two sphingosine 1-phosphate(S1P)receptors,S1P(2)/LP(B2)/EDG-5 and S1P(3)/LP(B3)/ EDG-3.J Biol Chem,2002,277(28):25152-25159.

Construction and function identification of short hairpin RNA lentiviral vector targeting S1PR3.

WANG Hang1,2, HUANG Hao3,CAI Ke-yin2,DING Shi-fang1.1.Department of Cardiovasology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military,Wuhan 430070,Hubei,CHINA;2.Second Department of Geratology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military,Wuhan 430070,Hubei,CHINA;3.Clinical Medical Center,Shenzhen Hornetcorn Biotechnology Co.Ltd.,Shenzhen 513000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo construct the short hairpin RNA(shRNA)lentiviral vector targeting sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3)gene and then detect the effect of shRNA on the migration of endothelial precursor cells(EPCs).MethodsThree siRNA interference sequences targeting S1PR3 gene were designed,synthesized and cloned into the lentivirus vector respectively.Recombinant lentivirus and control were extracted from the 293T cells,and the viral titer was checked by observing the expression of red fluorescent protein.The lentivirus with the best interferine effect was detected by Western-blot.Transwell assay was used to detect the migration of EPCs.ResultsRecombinant lentivirus with a high title and efficient infection were obtained by the lentivirus vectors system PHBLV-U6-RFP.48 h after plasmids and helper plasmids were co-transfected to 293T cells,the expression of red fluorescent protein was observed.Mouse EPCS could be efficiently infected.The expressions of S1PR3 in EPCS were significantly reduced,and its migration ability was significantly inhibited.ConclusionThe recombinant shRNA lentivirus targeting the S1PR3 gene were constructed successfully,and the effect of shRNA on the migration of EPCs was observed,which lays the groundwork for subsequent study of the role of S1PR3 in the repair process after vascular endothelial injury.

Lentivirus;Sphingosine-1-phosphate receptor 3(S1PR3);Endothelial precursor cells(EPCs);Cell migration

R-332

A

1003—6350（2016）10—1721—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.001

2016-01-31)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81300153）

丁世芳。E-mail：didigoe@163.com