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股骨頭壞死患者外周血乙酰肝素酶表達水平檢測及臨床意義

魯會田

(鄭州中醫(yī)骨傷病醫(yī)院,河南 鄭州450016)

本研究總結了2010年2月-2014年2月間在我院進行股骨頭壞死治療的60例患者的臨床資料，并檢測這些患者的外周血乙酰肝素酶，并分析患者外周血乙酰肝素酶水平與臨床診斷及治療的關聯，現報告如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1所需試劑血細胞裂解液(購自上海生工公司)；鼠抗人Hpa抗體、羊抗鼠HRP抗體(購自美國abcam公司)；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2主要儀器低溫臺式離心機(購自德國Thermo公司)；DYY-6C型高壓電泳儀、DZY-E5電轉儀(購自北京六一儀器廠)；-80℃超低溫冰箱、高壓滅菌器(購自日本SANYO公司)；凝膠成像分析儀(蘇凈安泰公司)等。

1.1.3一般資料 選取自2010年2月-2014年2月間在我院進行股骨頭壞死治療的60患者為研究對象。所有患者年齡為31-71歲，平均年齡51.72±7.24歲。其中男性患者為42例，女性患者為18例，病程為3-24個月。并以此期間來本院進行體檢的健康者為對照組。

1.1.4納入標準年齡為31-71歲，無飲酒史，無并發(fā)高血壓、糖尿病、腫瘤等嚴重疾病，近期無急、慢性炎癥病變，并且近期未使用抗凝或促凝等藥物。

1.1.5排除標準年齡<31歲或>71歲。有飲酒史，并發(fā)高血壓、糖尿病、腫瘤等嚴重疾病，近期有急、慢性炎癥病變，并且近期使用了抗凝或促凝等藥物。

1.2方法

1.2.1分組情況根據所有患者的影像學檢測結果ARCO分期情況進行分組，共分為Ⅰ期組、Ⅱ期組、Ⅲ期組、Ⅳ期組4組，每組15例患者。并以此期間來本院進行體檢的健康者為對照組，對照組為15例健康者。

1.2.2血樣取材在患者入院后次日以及手術治療1個月后采取患者的血液4 ml，對照組的健康者在體檢時采血4 ml。在采血時需空腹，采取肘靜脈血后每個樣品加入40 μl的EDTA，在室溫條件下靜置20 min，放置在4℃離心機中3 000 rpm離心15 min，使用移液器吸取血漿，加入到清潔的EP管中，放置在-80℃超低溫冰箱中保存留用。

1.2.3患者外周血乙酰肝素酶表達水平檢測使用血細胞裂解液提取總蛋白，吸取10 μl蛋白樣品，加入10 μl的2×上樣Buffer，混勻后加入到濃縮膠的上樣孔中，以60V的電壓進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后切下含有目的條帶的凝膠，放入電轉儀后放入PVDF膜進行轉膜。轉膜完后將PVDF膜取出沖洗干凈，加入鼠抗人Hpa抗體，放置在37℃條件下反應12 h，洗滌后向溶液中加入HRP標記的羊抗鼠抗體，室溫下反應6 h，洗滌后使用DAB顯色試劑盒對PVDF膜進行顯色。使用凝膠成像分析儀對顯色后的PVDF膜進行拍照，并使用Bandcan軟件進行灰度值分析。

2結果

2.1患者基本資料

對所有患者的基本資料進行統計，結果顯示，四組患者的例數、性別構成及平均年齡比較差異均不顯著(P>0.05)。顯示出四組患者的外周血乙酰肝素酶表達水平及病理檢測結果具有一定的可比性，詳細結果見表1。

2.2患者外周血乙酰肝素酶表達水平

檢測患者治療前后外周血乙酰肝素酶表達水平，結果顯示，Ⅰ期組、Ⅱ期組、Ⅲ期組、Ⅳ期組患者在治療后外周血乙酰肝素酶表達水平與對照組相比較差異均顯著(P<0.05)。Ⅱ期組、Ⅲ期組患者在治療后外周血乙酰肝素酶表達水平與對照組相比較差異均顯著(P<0.05)。Ⅰ期組、Ⅱ期組、Ⅲ期組、Ⅳ期組患者在治療前外周血乙酰肝素酶表達水平與治療前相比較差異均顯著(P<0.05)。詳細結果見表2。

表1　患者基本資料

表2　患者外周血乙酰肝素酶表達水平

與對照組相比較差異顯著*P<0.05，與治療前相比較差異顯著△P<0.05

3討論

股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是一種骨科臨床常見的疾病，但是臨床治療效果一般欠佳[1]。具體發(fā)病機制是當股骨頭供血出現中斷或受損的情況，從而造成骨細胞及骨髓成分死亡，之后便會使股骨頭的結構發(fā)生改變、股骨頭塌陷，患者的主要臨床癥狀是關節(jié)功能障礙和關節(jié)疼痛。

乙酰肝素酶(heparannese,Hpa)是哺乳動物細胞中硫酸肝素蛋白多糖側鏈-硫酸乙酰肝素的內源性糖苷酶，硫酸肝素糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)是Hpa 的天然底物，也是細胞外微環(huán)境的重要因子。Hpa可以降解 HSPG 的 HS 側鏈，使細胞外基質的結構產生變化，在加速血管生成的同時，對周圍炎癥和腫瘤細胞的游走轉移性有提高幫助作用，也會使HS 結合因子的釋放有所增加[2,3]。

股骨頭壞死的發(fā)病過程相對比較復雜，整個過程包括骨壞死、骨再生、纖維結締組織增生，并且這幾種情況相互交織出現。ARCOⅠ期股骨頭壞死很少出現骨再生的情況，主要是骨壞死，周圍血液為高凝狀態(tài)[4]。ARCOⅡ，Ⅲ期時骨壞死以及血凝的程度均明顯增加，并且出現骨再生的情況，這兩個時期的乙酰肝素酶含量逐漸增加。在ARCO Ⅳ期中，乙酰肝素酶的含量明顯較前減少，與ARCOⅠ期中含量相當[5]。

本研究對股骨頭壞死患者外周血乙酰肝素酶表達水平進行檢測，顯示乙酰肝素酶表達水平與不同ARCO分期情況密切相關。其中Ⅱ期、Ⅲ期患者在治療前后者外周血乙酰肝素酶表達水平均高于對照組的健康者。在進行手術治療后，所有患者的外周血乙酰肝素酶表達水平均有所下降。表明檢測患者外周血乙酰肝素酶表達水平可以對股骨頭壞死情況進行診斷和預測，從而為臨床提供更為簡便快捷的診斷方法，并且這種檢測方法對患者的傷害小，容易被患者及家屬接受。

參考文獻：

[1]成人股骨頭壞死診療標準專家共識(2012 年版) [J].中華骨科雜志，2012，32(6):606.

[2]Parish CR,Freeman C,Hulett MD.Heparanase:a key enzyme involved in cell invasion[J].Biochim Biophys Acta，2001，1471:M99.

[3]Vlodavsky I,Friedmann Y.Molecular properties and involvement of hep-aranase in cancer metastasis and angiogenesis[J].J Clin Invest，2001，108:341.

[4]Lykissas MG,Gelalis ID,Kostas-Agnantis IP,et al.The role of hypercoa- gulability in the development of osteonecrosis of the femoral head[J]..Orthop Rev (Pavia)，2012，4(2):e17.

[5]Meirovitz A,Goldberg R,Binder A,et al.Heparanase in inflammation and inflammation-associated cancer[J].FEBS Journal，2013，280(10):2307.

文章編號：1007-4287(2016)01-0121-03

(收稿日期：2015-02-13)