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        云南紅豆杉中紫杉烷類化合物的提取工藝優(yōu)化

        2016-02-25 06:40:40沙喜陽黃士栩楊文婷
        化學(xué)與生物工程 2016年1期
        關(guān)鍵詞:纖維素酶正交實(shí)驗(yàn)

        徐 蕓,沙喜陽,吳 睿,黃士栩,楊文婷

        (武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,湖北 武漢 430065)

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        云南紅豆杉中紫杉烷類化合物的提取工藝優(yōu)化

        徐蕓,沙喜陽,吳睿,黃士栩,楊文婷

        (武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,湖北 武漢 430065)

        摘要:以云南紅豆杉樹皮為原料,采用纖維素酶法提取其中的紫杉烷類化合物。以酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度、料液比為考察因素,以紫杉烷類化合物得率為考核指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳工藝條件為:酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL),在此條件下,紫杉烷類化合物的得率為0.898%。該提取工藝操作簡單,提取條件溫和、穩(wěn)定。

        關(guān)鍵詞:云南紅豆杉;纖維素酶;紫杉烷類化合物;正交實(shí)驗(yàn)

        云南紅豆杉(Taxus yunnanensis)為紅豆杉科紅豆杉屬的常綠喬木,又名西南紅豆杉,是我國紅豆杉四大品種之一[1-3],主產(chǎn)于云南西北部及西部、四川西南部與西藏東南部[4]。從該植株中可提取紫杉醇、10-脫乙?;涂ǘ、?10-DAB)等紫杉烷類化合物。紫杉醇作為目前發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物之一,對多種晚期癌癥(如卵巢癌和乳腺癌等)有療效[5-7]。10-DAB具有紫杉烷類化合物母核結(jié)構(gòu),可以通過測定其含量考察紫杉烷類化合物的得率。紅豆杉樹皮堅(jiān)硬,紫杉烷類化合物的提取效率較低,不利于紅豆杉資源的充分利用。作者采用纖維素酶法對紅豆杉樹皮進(jìn)行處理,以提高其中紫杉烷類化合物的提取效率;以10-DAB得率作為評價(jià)指標(biāo),考察酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度以及料液比對紫杉烷類化合物得率的影響,通過正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝條件,擬為紅豆杉資源的充分利用提供參考[8-9]。

        1實(shí)驗(yàn)

        1.1 材料、試劑與儀器

        云南紅豆杉樹皮,杭州民泰中藥飲片有限公司。

        纖維素酶(活力大于30U·mg-1,進(jìn)口分裝);10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于95%),紅豆集團(tuán);無水乙醇(分析純),天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;檸檬酸(分析純),天津凱通化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸鈉(分析純),天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;石油醚(分析純,沸程60~90 ℃),天津百世化工有限公司。

        752型紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;KQ-50E型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;TDZ5-WS型離心機(jī),長沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司;中藥材粉碎機(jī),浙江瑞安春海藥材機(jī)械廠。

        1.2 方法

        1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精確稱取10mg10-DAB,甲醇溶解并定容于100mL容量瓶,得濃度為0.1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL于6個(gè)10mL容量瓶中,定容后,227nm下測定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為A=33.375c-0.0317,R2=0.9994。

        1.2.2紅豆杉樹皮中紫杉烷類化合物得率的測定

        取適量云南紅豆杉樹皮放入粉碎機(jī)中粉碎,過30目篩。以料液比1∶3(g∶mL)用石油醚浸泡粉末12h,除去脂類及部分脂溶性色素,然后于40 ℃下烘干除去溶劑,得云南紅豆杉樹皮粉末,陰涼處保存?zhèn)溆肹10]。精密稱取一定量的紅豆杉樹皮粉末和纖維素酶,加入一定量的pH=5的檸檬酸緩沖溶液,置于一定溫度下保溫一定時(shí)間后,5 000r·min-1離心5min,去上清液,加入無水乙醇20mL超聲處理30min,5 000r·min-1離心5min,上清液用無水乙醇稀釋一定倍數(shù),吸取適量的提取液,按1.2.1方法測定吸光度。根據(jù)下式計(jì)算紫杉烷類化合物得率。

        得率=[c×V×稀釋倍數(shù)/m]×100%

        式中:c為提取液中紫杉烷類化合物的濃度,mg·mL-1;V為提取液的體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,g。

        1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)

        1)酶處理時(shí)間對得率的影響

        稱取5份1.0g云南紅豆杉樹皮粉末,加入10mg纖維素酶和10mLpH=5的檸檬酸緩沖溶液,分別于40 ℃下保溫0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h,其它步驟同1.2.2。

        2)酶處理溫度對得率的影響

        稱取5份1.0g云南紅豆杉樹皮粉末,加入10mg纖維素酶和10mLpH=5的檸檬酸緩沖溶液,分別于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃下保溫1.0h,其它步驟同1.2.2。

        3)酶用量對得率的影響

        稱取5份1.0 g云南紅豆杉樹皮粉末,分別加入0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的纖維素酶,再加入10 mL pH=5的檸檬酸緩沖溶液,40 ℃下保溫1.0 h,其它步驟同1.2.2。

        4)料液比對得率的影響

        稱取5份1.0 g云南紅豆杉樹皮粉末,加入10 mg纖維素酶,分別按料液比(g∶mL,下同)1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入pH=5的檸檬酸緩沖溶液,40 ℃下保溫1.0 h,其它步驟同1.2.2。

        1.2.4正交實(shí)驗(yàn)

        根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以酶處理時(shí)間、酶用量、酶處理溫度以及料液比為考察因素,以得率為考核指標(biāo),采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝,正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

        表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

        Tab.1The factors and levels of orthogonal experiment

        水平因素A.酶處理時(shí)間hB.酶用量%C.酶處理溫度℃D.料液比g∶mL11.00.6351∶1221.50.8401∶1432.01.0451∶16

        2結(jié)果與討論

        2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.1.1酶處理時(shí)間對得率的影響(圖1)

        圖1 酶處理時(shí)間對得率的影響

        由圖1可知,當(dāng)其它條件一定時(shí),1.0 h是纖維素酶對云南紅豆杉樹皮粉末作用的最佳時(shí)間,超過1.0 h后,溶液中紫杉烷類化合物的得率開始呈下降趨勢。這是因?yàn)椋傅淖饔镁哂懈咝?,在一定時(shí)間內(nèi),纖維素酶對紫杉烷類化合物的提取過程持續(xù)進(jìn)行;但超過一定時(shí)間后,纖維素酶的活力隨作用時(shí)間的延長逐漸減弱,導(dǎo)致提取作用減弱或停止。因此,確定最佳酶處理時(shí)間為1.0 h。

        2.1.2酶處理溫度對得率的影響(圖2)

        圖2 酶處理溫度對得率的影響

        由圖2可知,其它條件不變時(shí),紫杉烷類化合物的得率隨著酶處理溫度的升高而逐漸上升,在酶處理溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到最高,超過40 ℃后逐漸下降。原因主要是溫度對纖維素酶的活力有一定的影響,溫度過低時(shí)酶的活力較低而不易達(dá)到最佳水平;溫度過高則會(huì)導(dǎo)致酶活力降低或者失活,從而導(dǎo)致得率降低。因此,確定最佳酶處理溫度為40 ℃。

        2.1.3酶用量對得率的影響(圖3)

        圖3 酶用量對得率的影響

        由圖3可以看出,在一定條件下,隨著酶用量的增加,紫杉烷類化合物得率升高,在酶用量為0.8%時(shí),紫杉烷類化合物得率最高;酶用量超過0.8%以后,紫杉烷類化合物得率下降。這是因?yàn)?,酶用量偏低時(shí),纖維素酶對底物提取作用不完全,導(dǎo)致紫杉烷類化合物的得率偏低;當(dāng)酶用量過多時(shí),酶對其它成分的提取作用也加強(qiáng),導(dǎo)致提取液中的雜質(zhì)增多,影響了酶對紫杉烷類化合物的提取作用。因此,確定最佳酶用量為0.8%。

        2.1.4料液比對得率的影響(圖4)

        圖4 料液比對得率的影響

        由圖4可知,一定條件下,隨料液比的降低,纖維素酶的提取效果逐漸提高,紫杉烷類化合物的得率逐漸升高;在料液比達(dá)到1∶14時(shí)紫杉烷類化合物的得率最高,提取效果最好;當(dāng)料液比繼續(xù)降低時(shí),紫杉烷類化合物的得率下降,提取效果下降。一般,料液比越小,即溶劑用量越大,提取物的得率越高,但是當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定值后,紫杉烷類化合物的提取已經(jīng)基本完全,若繼續(xù)加大溶劑用量,不僅會(huì)造成單位體積提取液中紫杉烷類化合物濃度的降低,提取液中溶出的其它成分也增多,而且還會(huì)造成溶劑和資源的浪費(fèi)。因此,確定最佳料液比為1∶14。

        2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表2)

        表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

        由表2可以看出,影響紫杉烷類化合物得率因素的大小順序?yàn)镈>B>A>C,即料液比>酶用量>酶處理時(shí)間>酶處理溫度。最優(yōu)提取工藝條件為A1B1C3D3,即酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16。

        2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

        按A1B1C3D3工藝條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,在最優(yōu)工藝條件下,紫杉烷類化合物的平均得率為0.898%,3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的RSD=0.85%,表明此工藝條件重復(fù)性良好。

        3結(jié)論

        采用纖維素酶法處理紅豆杉樹皮,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對酶法提取紫杉烷類化合物的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)工藝條件為:酶處理時(shí)間1.0 h、酶用量0.6%、酶處理溫度45 ℃、料液比1∶16(g∶mL)。在最優(yōu)工藝條件下,纖維素酶法提取云南紅豆杉樹皮中紫杉烷類化合物的得率可達(dá)0.898%。

        使用無毒的無水乙醇為提取溶劑,不僅縮短了工藝時(shí)間,簡化了工藝流程,還減少了有機(jī)溶劑的用量以降低對環(huán)境的污染。料液比對酶法提取紅豆杉樹皮中紫杉烷類化合物的影響相對較大,在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制料液比以保障紫杉烷類化合物的得率。纖維素酶法處理的工藝條件較溫和、穩(wěn)定,可為其工業(yè)化應(yīng)用提供一定參考。

        參考文獻(xiàn):

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        [3]趙春芳,余龍江,劉智,等.中國紅豆杉中主要紫杉烷類物質(zhì)的分布研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2005,25(1):89-93.

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        [8]韓金玉,肖劍,王華,等.紫杉醇的提取與純化技術(shù)[J].中草藥,2000,31(10):789-792.

        [9]金洪順,樓惠琴,蔣世春,等.從紅豆杉中提取紫杉醇的工藝研究[J].廣州化工,2014,42(10):88-91.

        [10]王志剛.曼地亞紅豆杉中紫杉醇的提取分離工藝及測定研究[D].長沙:中南大學(xué),2007.

        Optimization on Extraction Process of Taxanes fromTaxusYunnanensis

        XU Yun,SHA Xi-yang,WU Rui,HUANG Shi-xu,YANG Wen-ting

        (CollegeofEnvironmentalandBiologicalEngineering,WuhanTechnology

        andBussinessUniversity,Wuhan430065,China)

        Abstract:The taxanes were extracted from bark of Taxus yunnanensis by cellulase method.Using enzyme treatment time,dosage of enzyme,enzyme treatment temperature,solid-liquid ratio as factors and the taxanes yield as an index,the extraction process was optimized by singal factor experiment and orthogonal experiment.Results showed that,the optimal extraction conditions were as follows:enzyme treatment time 1.0 h,dosage of enzyme 0.6%,enzyme treatment temperature 45 ℃ and solid-liquid ratio 1∶16(g∶mL).Under above conditions,the yield of taxanes was 0.898%.The extraction process was simple in operation and the extraction conditions were stable and mild.

        Keywords:Taxus yunnanensis;cellulase;taxane;orthogonal experiment

        中圖分類號:O 629

        文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

        文章編號:1672-5425(2016)01-0039-04

        作者簡介:徐蕓(1994-),女,湖北孝感人,研究方向:天然產(chǎn)物提取,E-mail:1924337061@qq.com;通訊作者:楊文婷,講師,E-mail:47389578@qq.com。

        收稿日期:2015-09-24

        基金項(xiàng)目:武漢工商學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(S201416),武漢工商學(xué)院校級科研項(xiàng)目(A2014018)

        doi:10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.010

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