羅小蘭綜述，毛熙光審校（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

HPV16 E7蛋白在宮頸癌中的作用研究進(jìn)展

羅小蘭綜述，毛熙光△審校
（四川醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川瀘州646000）

宮頸腫瘤；人乳頭瘤病毒16；基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；疫苗；綜述

宮頸癌是全球女性惡性腫瘤的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。我國(guó)每年的新發(fā)病例占世界總新發(fā)病例的30%左右，且宮頸癌患者以每年2%～3%的速度增長(zhǎng)。近年來(lái)，多數(shù)宮頸癌調(diào)查結(jié)果顯示發(fā)病年齡趨于年輕化?，F(xiàn)有研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）感染特別是高危型HPV感染是絕大多數(shù)宮頸癌癌前病變和宮頸癌的主要原因［1］。而HPV16與HPV18在宮頸癌高危型HPV中最常見(jiàn)。HPV16型感染多見(jiàn)于宮頸鱗狀細(xì)胞癌（占宮頸癌的75%～80%），而HPV18多見(jiàn)于宮頸腺癌（占宮頸癌的20%～25%）。E6、E7基因持續(xù)表達(dá)是宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及持續(xù)進(jìn)展為宮頸癌浸潤(rùn)的必要條件［2］。而HPV16的早期基因E7是致癌的關(guān)鍵基因之一，E7基因編碼的E7蛋白能與成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白結(jié)合，進(jìn)一步使宿主細(xì)胞繞過(guò)R點(diǎn)，由DNA合成前期（G1期）直接進(jìn)入DNA合成期（S期），抑制宿主細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，對(duì)腫瘤血管的新生有促進(jìn)作用，與E6蛋白協(xié)同使細(xì)胞發(fā)生永生化等。但值得注意的是，E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個(gè)線性B細(xì)胞表位、CD4+T細(xì)胞表位和CD4+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位，與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子親和力高、抗原性強(qiáng)，是研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。E7在宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及細(xì)胞周期調(diào)控等方面起著重要作用，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

1　HPV16　 E7　蛋白的主要生物學(xué)特性

HPV16 E7蛋白由HPV16病毒的E區(qū)基因編碼，共含有98個(gè)氨基酸的酸性磷酸蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為16×103～18×103。HPV16 E7蛋白有3個(gè)主要的功能區(qū)域：Ⅰ區(qū)位于第1～15位氨基酸；Ⅱ區(qū)位于第16～37位氨基酸，Ⅱ區(qū)有1個(gè)與腫瘤抑制蛋白R(shí)B相結(jié)合的位點(diǎn)LXCXE，位于第22～26位氨基酸。LXCXE通過(guò)與RB結(jié)合，促進(jìn)其降解，使原本與之結(jié)合的真核細(xì)胞起始轉(zhuǎn)錄因子E2F失去調(diào)控而釋放，使細(xì)胞進(jìn)入S期，引起細(xì)胞周期失調(diào)。Ⅱ區(qū)還含1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）位點(diǎn)，該位點(diǎn)上的第31、32位絲氨酸常被磷酸化，增加了HPV16 E7蛋白與轉(zhuǎn)錄因子IID（TFIID）的關(guān)鍵組件TATA合子結(jié)合蛋白的親和性，而TFIID通過(guò)與啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。Ⅲ區(qū)位于第38～98位氨基酸，該區(qū)域內(nèi)含2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和多個(gè)CTL的識(shí)別位點(diǎn)，可使細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)［3］?，F(xiàn)以CTL表位為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)以E7蛋白位靶抗原的治療性肽疫苗的研究越來(lái)越受到重視［4］。HPV16 E7蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域內(nèi)的LRLCV（第65～69位氨基酸）通過(guò)與核孔蛋白62（NUP 62）的FG區(qū)作用使E7能順利進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)［5］。若E7蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)發(fā)生突變，E7蛋白就失去使細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。

2　HPV16　 E7　蛋白在宮頸癌發(fā)生中的作用及其機(jī)制

2.1E7蛋白與pRB相互作用，使宿主細(xì)胞失去正常細(xì)胞周期調(diào)控作用細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程。細(xì)胞周期分為G1期、S期、DNA合成后期（G2期）及細(xì)胞分裂期（M期）。HPV16 E7蛋白含有2個(gè)高度保守的CR1、CR2區(qū)域及1個(gè)羧基端。羧基端內(nèi)存在2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。CR2中Leu-X-Cys-X-Glu（LXCXE）結(jié)構(gòu)，能與pRB相互作用，使其發(fā)生磷酸化，釋放原本結(jié)合在pRB上的另一細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F。E2F可作用于含有E2F結(jié)合位點(diǎn)的下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的基因，引起一系列調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的細(xì)胞因子的改變，如細(xì)胞周期蛋白、p16、p107、P130及c-Myc等，使宿主細(xì)胞繞過(guò)R點(diǎn)，由G1期直接進(jìn)入S期，抑制宿主細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控［6］。另有研究表明，E7蛋白能與叉頭框蛋白M1（FoxM1）結(jié)合，并增加E7蛋白的轉(zhuǎn)化活性及FoxM1的轉(zhuǎn)錄活性，從而使正常細(xì)胞周期失調(diào)［7］。

2.2HPV16 E7蛋白能夠促進(jìn)腫瘤血管新生任何腫瘤的發(fā)生都必須有血管的新生過(guò)程。腫瘤的新生血管與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，因其能為腫瘤細(xì)胞提供足夠的氧氣和養(yǎng)料，且部分腫瘤細(xì)胞可通過(guò)新生的血管發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。血管生成的過(guò)程與低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）密切相關(guān)，且受到微環(huán)境中多種細(xì)胞因子的影響，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等。在常氧環(huán)境下，HIF-1α脯氨酸發(fā)生羥基化，與von Hippel-Lindau蛋白結(jié)合，觸發(fā)泛素-蛋白酶體蛋白水解，使其半衰期迅速變短［8］。HPV16 E7蛋白可誘導(dǎo)組蛋白去乙?；概cHIF-1α分離，使HIF-1α依賴受體活性上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管的新生［9］。HP16 E7和RB蛋白結(jié)合釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F與HPV E7基因下游的核糖核苷酸還原酶亞基M2基因結(jié)合，產(chǎn)生活性氧，激活ERK1/2信號(hào)通路，使HIF-1α和VEGF表達(dá)上調(diào)來(lái)促進(jìn)血管新生，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［10］。免疫組織化學(xué)分析表明，RRM2水平與人類宮頸癌HPV16 E7水平呈正相關(guān)。HPV16表達(dá)E7只能使促血管生成因子表達(dá)顯著增加，但并不足以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

2.3HVP16 E7蛋白與視黃酸受體β基因（RARB基因）的關(guān)系RARB基因是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物能抑制E6、E7基因的轉(zhuǎn)錄。RARB基因可通過(guò)分離轉(zhuǎn)錄因子AP-1與病毒調(diào)控區(qū)域，減弱HPV基因的表達(dá)。RARB基因甲基化可導(dǎo)致該基因沉默，使RARB表達(dá)缺失，對(duì)HPV16 E6、E7基因的抑制作用消失，從而E7蛋白的表達(dá)增高，促進(jìn)了癌癥的發(fā)生［11］。有研究表明，轉(zhuǎn)染RARB質(zhì)粒的Hela細(xì)胞可表達(dá)視黃酸，從而抑制單克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)［12］。但Gutiérrez等［13］提出HPV16 E7蛋白使被HPV16感染細(xì)胞的RARB mRNA 和RARB蛋白表達(dá)增高；在表達(dá)E7蛋白的細(xì)胞中，RARB的過(guò)表達(dá)進(jìn)一步導(dǎo)致了腫瘤抑制基因p53R237C突變的發(fā)生。RARB基因?qū)儆谀[瘤抑癌基因，理論上其在宮頸癌細(xì)胞中應(yīng)不表達(dá)或表達(dá)下調(diào)，但多項(xiàng)研究已證實(shí)，RARB蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增高，其具體機(jī)制目前仍不清楚。RARB作為新的抑癌基因，現(xiàn)仍有許多問(wèn)題尚不清楚，其與HPV感染的關(guān)系，在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)的原因尚需進(jìn)一步探索。

2.5E7蛋白與感染HPV16細(xì)胞的免疫反應(yīng)及治療性疫苗HPV16 E7蛋白可與E6蛋白協(xié)同改變細(xì)胞微環(huán)境，形成有利于癌細(xì)胞發(fā)生的微環(huán)境，逃避宿主的固有免疫應(yīng)答，使宿主細(xì)胞的功能發(fā)生改變，導(dǎo)致宿主細(xì)胞的永生化。E6、E7蛋白還可作用于細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白，引起宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，還可以通過(guò)影響宿主的免疫功能逃避宿主對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的免疫監(jiān)視作用，造成HPV16的持續(xù)感染。持續(xù)性的高危型HPV感染是宮頸癌的重要原因。E6、E7蛋白使促炎性細(xì)胞因子，如白介素-18（IL-18）、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3α等趨化因子表達(dá)下降，并能使抗炎分子IL-18結(jié)合蛋白高表達(dá)［14］，進(jìn)而抑制免疫反應(yīng)。E6、E7蛋白能通過(guò)操縱細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路來(lái)抑制抗病毒轉(zhuǎn)錄因子的活化，包括核因子-κB（NF-κB）和干擾素等［15］。有研究表明，E7蛋白能通過(guò)改變核易位和p65乙?；饔脕?lái)阻斷NF-κB的活化，進(jìn)而降低咪喹莫特對(duì)HPV16病毒感染的治療效果［16］。

隨著科技的進(jìn)步宮頸癌的治療方法（手術(shù)、放療、化療技術(shù)）在不斷提高，但每年仍然有成千上萬(wàn)的人死于宮頸癌［17］?，F(xiàn)已有默克公司針對(duì)HPV6/16/18的四價(jià)疫苗和葛蘭素史克公司針對(duì)HPV16/18的二價(jià)疫苗通過(guò)美國(guó)食品藥物監(jiān)督管理局審批，予以上市投入使用［18］。但這些預(yù)防性疫苗開(kāi)始使用的時(shí)間建議在無(wú)性生活前（12歲前），接種對(duì)象是未被HPV感染的健康人群，且對(duì)已感染相關(guān)HPV的女性無(wú)治療效果［19］。因此，迫切需要研發(fā)針對(duì)已感染HPV人群的治療性疫苗。宮頸癌HPV治療性疫苗是指通過(guò)機(jī)體的免疫作用消除或減少體內(nèi)已被HPV感染的細(xì)胞，從而減少宮頸上皮內(nèi)瘤變或?qū)m頸癌的發(fā)生。E7腫瘤蛋白是一種外源性蛋白，僅在HPV感染的細(xì)胞中高表達(dá)［20］，且是宮頸癌發(fā)生過(guò)程中必不可少的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。這些特性使得E7蛋白成為最適合的治療性HPV疫苗的特異性靶抗原［21］。目前治療性HPV疫苗的研制雖已經(jīng)取得一定成果。Trimble等［22］已證實(shí)，針對(duì)HPV16 E6、E7蛋白的DNA疫苗VGX-3100疫苗對(duì)HPV16和HPV18感染所致的中、重度宮頸上皮內(nèi)瘤變治療效果顯著，為宮頸上皮內(nèi)瘤變患者提供了除手術(shù)治療外的治療方案。治療性疫苗的形式多樣化，除vgx-3100 類DNA疫苗外，還有肽類疫苗、蛋白疫苗、載體疫苗及細(xì)胞疫苗等。但治療性疫苗仍有許多問(wèn)題需要改善，比如怎樣提高疫苗的安全性和提高疫苗的免疫原性等。

不同HPV亞型間的E7蛋白具有同源性。當(dāng)E7與RAS蛋白結(jié)合時(shí)，能使其保持低表達(dá)水平，減弱其誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的過(guò)程，從而導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖；有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)E7蛋白在HPV16感染細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)時(shí)，可使永生化細(xì)胞的端粒酶活性的穩(wěn)定性進(jìn)一步增高［23］。PT-3可通過(guò)抑制感染HPV的CaSki細(xì)胞表達(dá)E6、E7來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。PT-3能使CaSki和Hela的生長(zhǎng)動(dòng)力減緩，然而這一作用對(duì)HPV陰性的C33A細(xì)胞無(wú)效［24］。而E2蛋白針對(duì)E7蛋白與其他細(xì)胞內(nèi)蛋白的關(guān)系仍在探索中。

當(dāng)敲除CaSki細(xì)胞的HPV16 E6和E7基因后，宮頸癌CaSki細(xì)胞增殖受到抑制，能促進(jìn)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡，并降低宮頸癌CaSki細(xì)胞遷移和侵襲的能力［25］。

綜上所述，E7蛋白作為HPV16 E7基因編碼的關(guān)鍵腫瘤蛋白，在宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及細(xì)胞周期調(diào)控等方面起著重要作用，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。因?yàn)镠PV16 E7蛋白作為腫瘤特異性排斥抗原，含多個(gè)線性B細(xì)胞表位、CD4+T細(xì)胞表位和CD4+CTL表位，與MHC分子親和力高，具有很好的抗原性；僅在HPV16感染的細(xì)胞中表達(dá)，屬于外源性蛋白；E7蛋白可在宿主細(xì)胞表面持續(xù)性表達(dá)，因?yàn)镋7的持續(xù)性表達(dá)使其抗原性得以持續(xù)存在，這些因素都使得E7蛋白成為研制HPV治療性疫苗的首選靶抗原。雖然HPV治療性疫苗的研發(fā)和使用仍會(huì)面臨許多挑戰(zhàn)，但隨著科技的發(fā)展，針對(duì)E7的治療性HPV疫苗的進(jìn)一步研發(fā)，對(duì)控制HPV感染所致子宮頸癌的發(fā)病率有著跨時(shí)代的作用。

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（2015-10-23）