云　璐，王　榮，趙　海，楊　海，2

(1. 山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042；2. 中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室/醫(yī)藥學院,山東 青島 266003)

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中藥及組方物質(zhì)基礎(chǔ)研究進展

云璐1，王榮1，趙海1，楊海1，2

(1. 山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266042；2. 中國海洋大學海洋藥物教育部重點實驗室/醫(yī)藥學院,山東 青島 266003)

[關(guān)鍵詞]中藥；組方；物質(zhì)基礎(chǔ)研究；方法

中藥及組方是中藥臨床使用的主要表現(xiàn)形式，對于中藥組方藥理活性成分的研究是中藥現(xiàn)代化及國際化的必有出路。由于中藥組方成分的復雜性、多樣性，藥理作用的多靶點、多途徑、多效應(yīng)等，給中藥組方物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)中藥組方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究多集中在單味藥的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，取得了一些成果，如青蒿素、石杉堿甲、川芎嗪、五味子素、聯(lián)苯雙酯、銀杏內(nèi)酯等，但是這種拆方研究沒有體現(xiàn)中醫(yī)治療疾病的整體性、系統(tǒng)性，沒有全面闡述中藥組方效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著藥學研究多學科多領(lǐng)域的交叉發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出一些新思路、新方法、新技術(shù)，為闡明中藥組方的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了幫助。

1中藥有效部位(群)研究

中藥有效部位是指從單味藥材或組方中提取得到的具有相近化學性質(zhì)的一類化合物(藥效成分群)，有效部位要求標準是：提取物中某一類有效成分可控量達到50%以上；有效部位群是幾類有效部位的集合，標準是某幾類化學成分的可控總量達50%以上[1]。有效部位(群)的研究模式與中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論相吻合，注重中醫(yī)藥的“整體觀”“模糊思維模式”“性味歸經(jīng)”及中藥“君、臣、佐、使”配伍理論，基本能夠闡述清楚是什么物質(zhì)在中藥或組方中起治療作用及這些物質(zhì)是怎樣在起治療作用的“兩個基本講清”理論[2-3]。中藥有效部位(群)的研究方法過濾掉無效成分，突出有效組分，體現(xiàn)中藥多成分的特點，又能對藥物活性成分進行富集，達到“去偽存真”。該方法對提高中藥制劑質(zhì)量控制的針對性，同時提高中藥制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。組方CBN的有效部位為葛根黃酮和三七皂苷，總含量在80%以上，用于治療腦血管系統(tǒng)，李敏等[4]對組方CBN的有效部位的藥代動力學進行了研究，表明該方法實驗因素相對可控，既體現(xiàn)了中藥組方的多成分性，又解決了中藥組方體內(nèi)藥代動力學的局限性。在抗病毒中草藥的組方研究中，黃升海等[5]從黃芪、黃芩、柴胡等組方中藥中提取有效成分組成混合體，制成中藥有效部位新藥TCM-ES，該新藥具有抗流感病毒作用，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。周明學等[6]對活血、解毒、活血解毒中藥有效部位(三七總皂苷、黃連提取物、虎杖提取物、大黃醇提物)改善及穩(wěn)定斑塊、調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥反應(yīng)進行研究，發(fā)現(xiàn)該中藥組方的有效部位藥理作用明確，作用機制清楚。中藥有效部位(群)研究起步較晚，在中藥有效部位“有效性”的篩選及確定方面還存在一些問題，如缺乏主動探索和比較藥理學研究意識[7]。中藥有效部位確立要在中醫(yī)藥理論指導下，根據(jù)中藥藥性、功效采用相對應(yīng)的藥理學指標建立模型，對各組分進行活性追蹤，利用現(xiàn)代分析技術(shù)手段確定大類成分類型，最終確定有效部位[8]。

2中藥指紋圖譜

中藥指紋圖譜具有特征性、穩(wěn)定性、整體性及模糊性等特點，能客觀地反映中藥組方化學成分的復雜性及整體性。目前中藥指紋圖譜測定方法較多，如色譜法、光譜法、及多維指紋圖譜、中藥蛋白質(zhì)指紋圖譜、掃描電鏡指紋圖譜、計算機圖像指紋圖譜、基因組學指紋圖譜等。多維指紋圖譜能在色譜分離的同時運用不同光譜檢測器進行在線檢測，建立不同物質(zhì)屬性多維圖譜[9]。胡建蘭等[10]采用高效液相色譜法(HPLC)采用二極管陣列檢測器(DAD)對涼膈散湯劑建立指紋圖譜，共確定共有峰22個，其中8個色譜法確定其化學成分，該指紋圖譜能體現(xiàn)涼膈散湯劑的整體特征。聶晶等[11]采用HPLC-UV對生血寧片的特征指紋圖譜進行了研究，得到了分離度及重復性均較好的片劑特征指紋圖譜，并利用UPLC-DAD-Q-TOF-MS技術(shù)對其主要色譜峰進行了初步歸屬，為更好地控制生血寧片的質(zhì)量提供了可靠依據(jù)。耿放等[12]建立了桂枝茯苓丸脂溶性成分GC-MS指紋圖譜從整體定性方面評價桂枝茯苓丸的質(zhì)量優(yōu)劣。孫國祥等[13]建立了防風通圣丸的高效液相色譜指紋圖譜、紫外光譜指紋圖譜、紅外光譜指紋圖譜及熱值譜．形成多元多維方法交叉評價防風通圣丸質(zhì)量的方法。陳新新等[14]建立了六味地黃丸的五波長高效液相色譜指紋圖譜、紫外指紋圖譜和導數(shù)指紋圖譜，為其藥效物質(zhì)均一性的評價提供了一種有效的方法。多維中藥指紋圖譜實現(xiàn)了分析方法和檢測方法的多維化，能獲得到中藥組方化學成分的全信息分析而形成立體多息譜。非線性化學指紋圖譜利用非線性反應(yīng)，如化學振蕩、化學斑圖等化學混沌反應(yīng)，測定中藥等成分極為復雜的樣品[15]。向鳳琴等[16]以Mn2+-H+-BrO3--CH3COCH3，和作為耗散物的中藥還原活性成分作為測定指紋圖譜的基本非線性化學體系，測定了9批中藥的非線性化學指紋圖譜,該圖譜科學直觀反映中藥的定量信息與中藥成分之間的定量關(guān)系。魏航等[17]將灰色系統(tǒng)理論應(yīng)用在中藥指紋圖譜模式識別中，比較指紋圖譜特征變量數(shù)據(jù)序列與理想圖譜特特征之間的關(guān)聯(lián)度，從而達到品種識別和質(zhì)量評價的目的。另外還有研究對中藥建立了三維熒光指紋圖譜數(shù)據(jù)庫[18]，鄒慧琴等[19]將逐步辨別法應(yīng)用在氣味中藥指紋圖譜中。這些依托計算機模型及程序運算的新技術(shù)新方法擴大了指紋圖譜在中藥組方中應(yīng)用，為加強中藥質(zhì)量控制及中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了方法參考。

3中藥血清學

按照血清藥理學的理論，經(jīng)口服給藥后有效成分入血，進入體循環(huán)才能發(fā)揮藥效，這為中藥組方物質(zhì)基礎(chǔ)的血清學研究提供了理論支持。中藥組方成分多樣復雜，利用血清學研究物質(zhì)基礎(chǔ)可以排除干擾，較為準確、真實地反映中藥組方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通過現(xiàn)代微量藥學分析技術(shù)，如高效液相色譜法、質(zhì)譜法等測定血清中物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，可以將藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)聯(lián)系起來。該方法最早由田代真一提出。付克等[20]運用HPLC-UV法分析了大鼠口服柴芩清肝湯后血中移行成分，共檢測14個移行成分，其中8個為該中藥組方的原型成分，6個為體內(nèi)代謝產(chǎn)物，這為柴芩清肝湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究開辟了新的途徑。金慧等[21]運用中藥血清學原理對葛根芩連湯的動物實驗共發(fā)現(xiàn)31個入血成分，其中15個為該中藥組方的原型成分，13個為體內(nèi)代謝產(chǎn)物，3個為新物質(zhì)。有研究通過給大鼠服用七味消炎湯后進行血清分析，確定了該中藥組方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)為蘆薈大黃素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷-7、番瀉苷A[22]。在對芍藥甘草組方的研究中，張梁等[23]對該中藥組方血中移行成分進行歸屬，使用HPLC法共測定18個組分，其中13個為組方原型組分，3個為代謝組分。 曹藝等[24]建立了歸苓片血清移行組分的高效液相指紋圖譜，并對指紋圖譜進行了成分歸屬。在對六味地黃丸血中移行成分的研究中，孫暉等[25]將六味地黃丸主要血中移行成分添加到大鼠成骨細胞培養(yǎng)液中，測MTT法測定細胞增殖速度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血中移動行成分中莫諾苷、獐牙菜苷、馬錢子苷是其治療骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；王喜軍等[26]通過隨機對照實驗同樣發(fā)現(xiàn)上述三種物質(zhì)是六味地黃丸補腎丸補腎的主要藥效成分。由于血清本身成分復雜，受內(nèi)源性物質(zhì)的影響某些中藥活性微量成分可能無法檢測；另外血清中個體差異大，不同病理生理狀態(tài)對實驗結(jié)果的影響較大，這些都使得血清藥理學的發(fā)展受到制約。

4高通量篩選

中藥組方成分相對復雜，活性產(chǎn)物鑒定、活性成分篩選相對困難且工作量大，高通量篩選技術(shù)解決了中藥中一些成分藥理作用強，含量低，難以純化和篩選的難題[27]。目前高通量篩選技術(shù)主要包括生物芯片技術(shù)[28]、親和超濾技術(shù)[29]、生物色譜技術(shù)[30]等。

目前在生物芯片技術(shù)中應(yīng)用最多的為基因芯片，是中藥基因組學研究的主要工具[31]?；蛐酒夹g(shù)為中藥組方活性成分篩選、藥效作用靶點、毒性反應(yīng)等研究提供高通量、自動化分析。Rho等[32]對六味地黃丸衍生方醇提取物抗衰老作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)實驗大鼠海馬區(qū)腦磷脂甲基轉(zhuǎn)移酶及甲狀腺素轉(zhuǎn)運蛋白等相關(guān)基因高度表達。Bonham等[33]采用基因芯片對中藥成分PC-SPES治療前列腺癌的作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)與細胞周期調(diào)控、細胞結(jié)構(gòu)和雄激素水平有關(guān)。在中藥組方對糖尿病的治療研究中，姜德友等[34]通過基因芯片研究中藥糖心康對糖尿病大鼠心肌基因表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥組方的作用明顯優(yōu)于有效成分作用。在對中醫(yī)診斷腎虛證的研究中，韓清民等[35]利用基因芯片技術(shù)檢測補腎中藥對骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的基因表達，結(jié)果表明補腎中藥能上調(diào)軟骨細胞抗凋亡和增殖基因，抑制炎癥因子延緩軟骨退行性病變。中藥及組方可以通過多種途徑抑制腫瘤微血管生長[36]。托婭等[37]利用基因芯片技術(shù)，從基因水平解釋抗腫瘤血管生成中草藥的有效組分T3的分子機制。

親和超濾技術(shù)是將親和層析的高選擇性和超濾技術(shù)的高處理能力有效結(jié)合的技術(shù)[38]，該技術(shù)在小分子藥物篩選及藥物代謝方面研究較多[39-41]。由于該技術(shù)具有用量少，特異性高，靈敏度高等特點，中藥組方的研究也逐漸開展，有研究利用離心超濾-HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)研究中藥忍冬與小牛胸腺DNA有結(jié)合活性的化合物[42]。吳新安等[43]利用生物親和超濾技術(shù)以COX2酶為靶酶，在中藥提取物中加入該靶酶抑制劑塞來昔布及逆行篩選，結(jié)合HPLC-DAD和HPLC-MS技術(shù)進行快速分離檢測，成功分離目標化合物塞來昔布。陶益等[44]采用親和超濾耦聯(lián)HPLC-MS快速檢測山楂葉中的α-淀粉酶抑制劑的3個活性成分。有研究利用離心超濾-HPLC-DAD-MS聯(lián)用研究忍冬與小牛胸腺DNA在抗腫瘤、抗病毒、抗菌等反面的活性化合物[45]。另外近年來超濾技術(shù)在苷類、多糖類物質(zhì)中均有應(yīng)用[46]。

目前常規(guī)色譜分離手段如液相色譜、質(zhì)譜、氣相色譜在中藥成分研究中應(yīng)用廣泛，但是同樣存在一些不足，如注重分離及結(jié)構(gòu)分析，無法在線進行藥理活性測定。將色譜技術(shù)與分子生物技術(shù)結(jié)合形成了生物色譜技術(shù)。該技術(shù)將將有活性物質(zhì)鍵合在載體上，形成固定相，根據(jù)色譜原理進行分離、鑒定、活性研究等[47]，這些活性物質(zhì)主要有生物大分子、靶標或蛋白、活性細胞膜、活細胞等。Wang等[48]將人血清白蛋白鍵合硅膠柱以此分析龍膽瀉肝湯的活性組分的生物指紋圖譜，實驗對100種組分進行了分離和分析。毛希琴等[49]將高效液相色譜固定化載體蛋白色譜、固定化脂質(zhì)體色譜聯(lián)用模擬中藥藥代動力學過程，并對川芎的活性成分進行篩選，結(jié)果得到既有細胞膜活性成分又有載體蛋白結(jié)合能力的成分并對其中的2種進行了結(jié)構(gòu)鑒定。Tan等[50]用牛血清蛋白生物整體柱對當歸提取液進行了方法學考察，在梯度洗脫的條件下分離得到2個組分，采用HPLC和氣質(zhì)聯(lián)用確證2組分共5種成分來自當歸提取液。Dong等[51]采用紅細胞膜提取和HPLC分析當歸中活性成分。有研究采用人血小板提取與LC-DAD-ESI-MS/MS聯(lián)用對三七中抗血小板聚集成分進行了檢測，證實了該方法的可行性[52]。

5中藥代謝組學

代謝組學(Metabonomics)的概念首次由Jeremy Nicholson教授提出[53]，是研究生物體新陳代謝的變化規(guī)律，揭示機體生命活動代謝本質(zhì)的科學。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究應(yīng)該與中藥藥理作用的多成分、多靶點、協(xié)同作用等特點相適應(yīng)。在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學對于模型識別和確證、作用機制、藥物有效性和安全性、中藥資源和質(zhì)量控制研究等方面具有理論意義和應(yīng)用價值[54]。中藥代謝組學主要采用核磁共振(NMR)技術(shù)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS LC-MS)技術(shù)，建立一種非破壞性、整體、動態(tài)的研究方法，以此揭示中藥治療疾病過程中一系列機體化學變化，從而發(fā)現(xiàn)中藥組方的物質(zhì)基礎(chǔ)[55]。中藥代謝組學在中藥組方配伍規(guī)律的研究方面，Keiko等[56]采用CE-MS技術(shù)對當歸芍藥散提取物進行高通次級代謝產(chǎn)物篩選，東鑒定119個次級代謝產(chǎn)物，通過與組方中單味藥成分對比發(fā)現(xiàn)組方中茯苓、蒼術(shù)有利尿作用，當歸、石斛有調(diào)理氣血功能。柳長鳳等[57]基于代謝組學技術(shù)采用主成分分析法和正交偏最小二乘-判別分析法對獲得的數(shù)據(jù)進行處理，分析了黃連解毒湯組方中君臣佐使的配伍規(guī)律。有研究采用NMR對牛黃解毒片配伍進行研究發(fā)現(xiàn)大黃、黃芩、桔梗和甘草課題調(diào)節(jié)能量、膽堿、氨基酸代謝，并緩和雄黃的毒性作用[58]。Wang等[59]同樣采用NMR法通過偏最小二乘-判別分析對朱砂安神丸不同配伍進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)朱砂安神丸可以抑制單一朱砂對肝臟和腎臟毒性作用。近年來有研究利用中藥代謝組學方法對黃連解毒湯、平肝方、麝香保心丸、金匱腎氣丸、逍遙散、雙龍方、四逆湯、通心絡(luò)膠囊、溫心方、下淤血湯、知柏地黃丸等進行藥效作用機制研究。由于代謝組學很難全面檢測代謝終端產(chǎn)物，不能對所有代謝產(chǎn)物進行定量、定性，不同的分析方法可能得到的分析結(jié)構(gòu)不同，個體差異對實驗結(jié)構(gòu)的影響較大、無完善的中藥代謝數(shù)據(jù)庫等，這些都是中藥代謝組學所面臨的問題。相信隨著上述問題的解決，中藥代謝組學在中藥組方物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制、中藥毒性反應(yīng)、活性成分篩選等方面有廣泛的應(yīng)用前景。

中藥組方物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥藥理活性研究的基礎(chǔ)，是“兩個基本講清”的基本內(nèi)容和重要環(huán)節(jié)。中藥組方成分的復雜性決定了其物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法的多樣性，通過不同研究方法對中藥組方藥理活性成分進行闡明，為中藥組方深度開發(fā)、市場推廣及臨床使用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

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[收稿日期]2015-12-10

[中圖分類號]R961

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)14-1589-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.14.041

[基金項目]青島中醫(yī)科研計劃(2015-zyy026)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2015-382)

[通信作者]楊海，E-mail：teaplate79@medmail.com.cn