賴月華 姚德生 杜 萍 盧 艷

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二病區(qū)，南寧市 530021，E-mail：1312867791@qq.com)

論著·基礎研究

人類微小RNA-1246慢病毒抑制載體的構(gòu)建及對宮頸鱗癌細胞增殖和侵襲的影響▲

賴月華 姚德生 杜 萍 盧 艷

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二病區(qū)，南寧市 530021，E-mail：1312867791@qq.com)

目的 構(gòu)建并鑒定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制載體，并探討miRNA-1246下調(diào)對宮頸癌細胞增殖及侵襲的影響。方法 針對miRNA-1246成熟體的反義核苷酸片段設計引物并合成目的基因miRNA-1246-down，應用基因重組技術將目的基因克隆到空載質(zhì)粒GV280中，通過酶切、PCR、DNA測序驗證重組慢病毒質(zhì)粒(GV280-miRNA-1246-down)的構(gòu)建是否成功，將GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共轉(zhuǎn)染293T細胞獲得重組慢病毒，濃縮提純病毒液并檢測病毒滴度，再用重組病毒液感染宮頸鱗癌細胞SiHa，通過檢測綠色熒光蛋白(GFP)驗證GV280-miRNA-1246-down在SiHa細胞的表達情況，用嘌呤霉素篩選GV280-miRNA-1246-down穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。將SiHa細胞分為空白組(NC組)、陰性病毒組(NC-LV組)、miRNA-1246下調(diào)組(miRNA-1246-down-LV組)，用細胞計數(shù)的方法檢測細胞的生長率，用Transwell檢測細胞侵襲能力。結(jié)果 (1)對菌落進行PCR鑒定篩選構(gòu)建正確的慢病毒載體,DNA測序證實插入的基因序列正確。(2)慢病毒將目的基因miRNA-1246-down成功導入SiHa細胞中，同時達到穩(wěn)定表達，轉(zhuǎn)染率達90%以上，在熒光顯微鏡下能直接觀察到GFP。(3)miRNA-1246-down-LV組 SiHa細胞增殖數(shù)低于其他兩組(P<0.05)，細胞穿膜次數(shù)較其他兩組減少(P<0.05)。結(jié)論 miRNA-1246慢病毒抑制載體構(gòu)建成功，miRNA-1246穩(wěn)定下調(diào)的SiHa細胞株建立成功。在SiHa細胞中miRNA-1246下調(diào)可抑制宮頸鱗癌SiHa細胞的增殖以及侵襲能力。

宮頸癌；慢病毒；微小RNA；抑制載體；增殖；侵襲

微小RNA (microRNA，miRNA)是一類由20～23個堿基組成的非編碼單鏈RNA，其與靶基因mRNA非翻譯區(qū)域的堿基互補配對，結(jié)合形成沉默復合體使mRNA降解，從而阻礙mRNA的翻譯[1]。miRNA的功能與細胞的分化、增殖、凋亡、耐藥、侵襲及轉(zhuǎn)移等密切相關[2]。腫瘤的多種生物學行為受到miRNA調(diào)控。筆者的前期實驗結(jié)果表明在宮頸癌患者的宮頸癌組織中miRNA-1246的表達量較癌旁組織、人宮頸正常組織升高；miRNA-1246是一個促癌因子，對人宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移能力具有一定的影響[3]。慢病毒載體是將人類免疫缺陷I型病毒改良后發(fā)展起來的用于基因治療的載體，是反轉(zhuǎn)錄病毒的一種，它對非分裂細胞和分裂細胞均具有較強的感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。由于對該病毒進行了改良，使之失去了傳染性能，因此安全性高。我們構(gòu)建了miRNA-1246慢病毒抑制載體，作為干預宮頸鱗狀細胞癌生長及體內(nèi)試驗的措施之一，為進一步觀察miRNA-1246在宮頸鱗狀細胞增殖中的作用及其機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源以及培養(yǎng)：人胚胎腎細胞(293T)、人宮頸鱗狀細胞癌細胞(SiHa細胞)均購于上海中國科學院。293T細胞用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，SiHa細胞用含10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株：攜帶增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒載體GV280以及Helper1.0、Helper2.0購自上海吉凱基因科技有限公司。GV280具有EGFP標志和氨芐西林抗藥基因。感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株購于北京天根生物科技公司。

1.1.3 主要試劑：AgeⅠ及EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司(生產(chǎn)批號：RO541V、RO552V、M0202L)；DL 10 000 DNA Marker購于上海TaKaRa公司(生產(chǎn)批號：l111042)，2×Taq PCR Master Mix購于上海吉凱基因科技有限公司，PCR引物合成及質(zhì)粒測序由上海吉凱基因科技有限公司進行(貨號：QPP01/QPP02)。質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自北京天根生物科技公司(貨號：DP115-01)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成：根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(http：//www.mirbase.org/cgi-bin/query.)得到人類miRNA-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG(序列編號：MIMAT0005898)，根據(jù)DNA重組要求及相關文獻[4]設計抑制載體：上游引物5′AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3′，下游引物5′-CCGG-CCTGCTCCAAAAATCCATT-3′。在上游引物的5′端及3′端分別加入限制性內(nèi)切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位點及相應的保護堿基，在上游引物的3′端加入6個T作為終止子。

1.2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建： 利用上述合成的引物合成目的基因(miRNA-1246-down)，并對目的基因進行PCR擴增，對GV280空載質(zhì)粒以及擴增得到的目的基因用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ及EcoRⅠ進行雙酶切酶切，按照酶切說明書操作，置于37°反應3 h或過夜，對載體酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，并測定其濃度。GV280空載質(zhì)粒與目的基因雙酶切線性化載體以1 ∶2的比例在T4DNA連接酶作用下進行連接，按照說明書操作，16°連接3 h或過夜。連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐霉素的Luria-Bertani固體培養(yǎng)基的平板上孵育，37° 5%的CO2培養(yǎng)過夜。

1.2.3 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定：挑取Luria-Bertani固體培養(yǎng)板上長出的單顆陽性菌落行PCR鑒定，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，引物為載體測序引物，對獲得的重組質(zhì)粒GV280-miRNA-1246-down插入的目的基因miRNA-1246-down進行自動測序，并與miRNA-1246反義核苷酸序列比較。將正確插入載體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌放入500 ml含氨芐霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)液中進行擴大培養(yǎng)，37°振蕩過夜，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒按照說明書提取質(zhì)粒，測定濃度和純度，用作以后的轉(zhuǎn)染。

1.2.4 GV280-miRNA-1246-down重組質(zhì)粒表達綠色熒光蛋白的檢測：GV280-miRNA-1246-down重組質(zhì)粒與lipo2000脂質(zhì)體以2 ∶1比例混合轉(zhuǎn)染293T細胞，于轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下可觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達。

1.2.5 重組慢病毒的包裝：將GV280-miRNA-1246-down重組質(zhì)粒以及包裝質(zhì)粒Helper1.0、Helper2.0以一定的比例混合用lipo2000脂質(zhì)體介導共轉(zhuǎn)染293T，8 h后跟換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，72 h后收集培養(yǎng)液上清，1 500 r/min離心5 min去除細胞碎片。再用孔徑為0.45 μm的一次性細胞濾器過濾去除所有的細胞及碎片，獲得的培養(yǎng)基上清則為含有目的基因的重組慢病毒液。

1.2.6 重組慢病毒滴度檢測：采用逐孔稀釋法，測定前1 d，將293T細胞接種于96孔板，每孔加入4×104個細胞，體積100 μl。分為8個組，第1組加入的病毒原液為10 μl記為1E+0 μl；第2組將病毒原液稀釋10倍后加入10 μl病毒稀釋液則所得的病毒原液為第一個Ep中的1/10，記為1E-1 μl，以此類推第3組到第8組分別為1E-2 μl、1E-3 μl、1E-4 μl、1E-5 μl、1E-6 μl、1E-7 μl感染病毒液，24 h后在顯微鏡下觀察細胞熒光數(shù)，則該病毒的滴度等于發(fā)熒光的細胞數(shù)除以病毒的原液量。

1.2.7 重組慢病毒感染SiHa細胞：感染前先做預實驗檢測SiHa細胞的moi值。感染前1 d將SiHa細胞以5×104/ml的密度接種于24孔板(細胞融合率為30%～40%)，分為3個組，標記為空白組(NC組)、陰性病毒組(NC-LV組)、miRNA-1246下調(diào)組(miRNA-1246-down-LV組)，感染前1 h換成增強感染液,然后按預實驗所得moi值向NC-LV、miRNA-1246-down-LV組中分別加入預先與聚凝胺混合好的陰性慢病毒以及GV280-miRNA-1246-down重組慢病毒，8 h后換成有血清培養(yǎng)基，分別于24 h、48 h、72 h在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達量。

1.2.8 SiHa細胞中miRNA-1246穩(wěn)定下調(diào)細胞系的構(gòu)建：重組慢病毒感染SiHa細胞72 h后當細胞長滿到90%以上時，將細胞用胰酶消化，1 200 r/min離心5 min，用含有2 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基制成懸濁液種到6孔板中(預實驗檢測得嘌呤霉素篩選的最適濃度為2 μg/ml)，每天用2 μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基換液。

1.2.9 細胞增殖實驗及細胞侵襲實驗：(1)將NC、NC-LV、miRNA-1246-down-LV 3組中長到80%生長對數(shù)期的細胞消化收集種于96孔板，每孔細胞約3 000個/100 μl，每組3個復孔，每個板3組細胞，種6個板。接種后48 h起開始消化收集細胞進行計數(shù)，每隔24 h一次，連續(xù)6 d。消化后的細胞加入臺盼藍，盼藍拒染法進行細胞計數(shù)，并繪制生長曲線。(2)將NC、NC-LV、miRNA-1246-down-LV 3組的細胞培養(yǎng)到80%處于生長對數(shù)期時，以2萬/每孔接種于Transwell小室上室，下室加入500 μl含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，每組重復3個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱總孵育12～15 h，用4%的多聚甲醇固定后蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。染色置于顯微鏡鏡下觀察并拍照，每個小室在顯微鏡下分別取上、中、下、左、右 5個視野，并在鏡下計數(shù)每個視野穿膜的細胞數(shù)，腫瘤細胞的侵襲能力以每視野細胞的平均數(shù)值來表示，此實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行分析，計量資料以(x±s)表示，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 陽性菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 對Luria-Bertani培養(yǎng)板上的菌落進行PCR篩選鑒定，將PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，如圖1所示，1～8號陽性轉(zhuǎn)化子片段大小在250～500 bp之間，而本實驗所用的目的基因(miRNA-1246-down)片段大小為271 bp，陽性轉(zhuǎn)化子所含基因片段大小符合目的基因片段大小，可推斷出目的基因成功轉(zhuǎn)入到陽性菌落中。

圖1 菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

注：從左到右12個通道，1：陰性對照(ddH2O)；2：陰性對照(空載自連對照組)；3：陽性對照(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)；4：Marker，自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 Kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5～12：為1～8號轉(zhuǎn)化子。

2.2 載體測序結(jié)果 載體經(jīng)測序證實結(jié)果符合預期，插入目的基因(miRNA-1246-down)片段與線性載體連接正確，符合設計要求，未見堿基缺失或突變等異常，證實已成功構(gòu)建此兩類載體，借助Vector NT軟件，將序列導入，繪制質(zhì)粒GV280-miRNA-1246-down結(jié)構(gòu)圖。見圖2。

圖2 重組慢病毒質(zhì)粒

注：puro：嘌呤霉素抗性基因；Amp：氨芐霉素抗性基因；miRNA-1246-down：目的基因；polyA：多聚腺苷酸；IRES：基因表達啟動子。

2.3 GV280-miRNA-1246-down重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導效率的檢測結(jié)果 用GV280-miRNA-1246-down重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下可觀察到100%的活細胞表達GFP(見圖3)，提示重組質(zhì)?？稍?93T細胞中成功表達。

2.4 SiHa細胞中miRNA-1246穩(wěn)定下調(diào)細胞系的構(gòu)建結(jié)果 重組慢病毒miRNA-1246-down-LV感染SiHa細胞72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達率只有50%，經(jīng)嘌呤霉素篩選后熒光顯微鏡觀察GFP表達率幾乎為100%，成功構(gòu)建了miRNA-1246穩(wěn)定下調(diào)的SiHa細胞系。見圖4及圖5。

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后的293T細胞

注：A：倍普通顯微鏡下圖(100×)，B： 494 nm綠色激發(fā)光熒光顯微鏡下圖(100×)。

圖4 重組慢病毒miRNA-1246-down-LV感染72 h后的SiHa細胞(嘌呤霉素篩選前)

注：A：倍普通顯微鏡下圖(200×)；B： 494 nm綠色激發(fā)光熒光顯微鏡下圖(200×)。

圖5 重組慢病毒miRNA-1246-down-LV感染后的SiHa細胞(經(jīng)嘌呤霉素篩選后)

注：C：倍普通顯微鏡下圖(200×)；D： 494 nm綠色激發(fā)光熒光顯微鏡下圖(200×)。

2.5 細胞增殖實驗結(jié)果 將3組細胞個孔進行細胞計數(shù)后取均值如表1，將3組細胞計數(shù)均值進行比較，我們發(fā)現(xiàn)通過感染miRNA-1246-down-LV慢病毒后，SiHa細胞的增殖能力明顯較NC組及NC-LV組細胞增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1及圖6。

2.6 細胞侵襲實驗結(jié)果 轉(zhuǎn)染了miRNA-1246-down-LV組SiHa細胞穿膜數(shù)量為(44.24±8.18)個，NC-LV組細胞穿膜數(shù)為(112.17±21.94)個，NC組細胞穿膜數(shù)為(112.60±16.93)個。miRNA-1246-down-LV組較其他兩組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

表1 各組細胞增殖情況(x±s，個)

圖6 細胞生長曲線圖

圖7 各組穿過膜的SiHa細胞(HE染色，×40)

3 討 論

最新研究表明miRNA參與動物包括人類生理或疾病狀態(tài)的調(diào)節(jié)，這其中包括細胞死亡或凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及炎癥反應等[5]。為了更為深入地闡明miRNA的作用機制，miRNA的功能學研究是不可或缺的。miRNA抑制表達的功能學研究可以采用很多方法，主要包括運用體外合成的miRNA抑制物或構(gòu)建相關抑制載體進行轉(zhuǎn)染[6]。針對宮頸鱗癌SiHa細胞轉(zhuǎn)染率低下的特點，本研究在以往實驗的基礎上構(gòu)建了相關miRNA的慢病毒載體，為下一步載體的包裝及假病毒顆粒的制備做好準備。慢病毒載體是體內(nèi)體外基因轉(zhuǎn)染的有力工具，該系統(tǒng)往往由3部分組成，即攜帶目的基因的載體質(zhì)粒、提供病毒結(jié)構(gòu)部件(gag/pol)質(zhì)粒以及提供病毒衣殼的質(zhì)粒構(gòu)成[7]，其主要有以下優(yōu)勢：(1)慢病毒對分裂及非分裂細胞都具有極強大的轉(zhuǎn)染能力；(2)慢病毒所攜帶的目的基因更能夠耐受轉(zhuǎn)錄沉默；(3)由慢病毒介導的目的基因轉(zhuǎn)染，可使目的基因整合到宿主染色體上隨宿主細胞分裂而傳給子代細胞，實現(xiàn)目的基因穩(wěn)定而持久地表達[8]。本研究采用的GV280質(zhì)粒，來源于人類免疫缺陷Ⅰ型病毒構(gòu)件，所構(gòu)建的載體中攜帶的目的基因在腦心肌炎病毒以及內(nèi)部核糖體進入位點的下游，具有EGFP熒光蛋白基因，能為目的基因的表達提供可靠的保證[9]。miRNA過表達載體的構(gòu)建可以采用miRNA的前體序列作為目的基因插入載體，也有研究采用的是包含miRNA前體序列兩端的側(cè)翼序列在內(nèi)的核苷酸并經(jīng)基因組DNA擴增后作為目的基因插入[10]。一般情況下當細胞內(nèi)miRNA高水平表達時采用反義寡核苷酸抑制其活性來下調(diào)其表達水平是目前比較理想的功能喪失研究手段。

本實驗成功構(gòu)建了慢病毒miRNA抑制表達質(zhì)粒GV280-miRNA-1246-down，具有極高的轉(zhuǎn)染效果，幾乎可以使100%的靶細胞SiHa獲得目的基因，由于它帶有GFP，可以通過熒光顯微鏡觀察有無綠色熒光GFP來了解靶細胞是否被轉(zhuǎn)導了目的基因，而無需繁瑣的免疫組化或者PCR方法驗證，簡化了實驗過程，目的基因可在2～3 d內(nèi)轉(zhuǎn)導入100%的靶細胞，達到穩(wěn)定表達。為轉(zhuǎn)基因的研究提供了快速、有效的工具，同時也為基因治療提供了有力的依據(jù)。細胞增殖以及侵襲實驗結(jié)果顯示，miRNA-1246-down-LV組SiHa細胞增殖數(shù)低于其他兩組(P<0.05)，細胞穿膜次數(shù)較其他兩組減少(P<0.05)，提示miRNA-1246的下調(diào)可以抑制宮頸癌SiHa細胞的增殖以及侵襲能力。這由于miRNA-1246是宮頸鱗狀上皮癌的致癌基因，因此其表達下調(diào)可以明顯抑制宮頸癌細胞的增殖以及侵襲。

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Construction of human microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector and its influence on proliferation and invasion of cervical squamous carcinoma cells

LAIYue-hua,YAODe-sheng,DUPing,DUYan

(TheSecondWards,DepartmentofGynecologicOncology,theAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To construct and identify human microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector,and to explore the influence of miRNA-1246 down-regulation on the proliferation and invasion of cervical carcinoma cells.Methods The gene sequences of microRNA-1246-down antisense olignuclleotides were cloned into GV280 lentiviral vector using gene recombination technique.The successful construction of recombinant lentiviral vector(GV280-microRNA-1246-down) was identified by enzyme digestion,PCR and DNA sequencing.GV280-microRNA-1246-down，Helper1.0 and Helper2.0 were transfected into 293T cells together to get recombinant lentivirus.The virus fluid was concentrated and purified,and then viral titers were measured.The cervical squamous carcinoma SiHa cells were infected by recombinant virus fluid.The expression of GV280-microRNA-1246-down in SiHa cell was identified by detecting green fluorescent protein(GFP).The cell lines stably transfected by GV280-microRNA-1246-down were screened using puromycin.The SiHa cells were divided into blank group(NC group),negative virus group(NC-LV group) and microRNA-1246 down-regulation group(microRNA-1246-down-LV group).The proliferation rate of the cells was detected by cell counting,and the invasive ability of the cells was detected by Transwell assay.Results ① The corrected lentiviral vector was screened from the bacterial by PCR,and DNA sequencing proved that the inserted gene sequence was correct.② The target gene microRNA-1246-down was successfully induced into SiHa cell through lentivirus and expressed stably,the transfection rate was almost 100% .GFP was observed directly under fluorescence microscope.③ The microRNA-1246-down-LV group obtained less cell counts of SiHa proliferation and decreased cell invasion compared to other two groups(P<0.05).Conclusion The microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector has been successfully constructed,and the SiHa cell lines stably transfected by microRNA-1246-down is established.Down-regulation of microRNA-1246 can inhibit the proliferation and invasion of cervical squamous carcinoma SiHa cells.

Cervical cancer,Lentivirus,MicroRNA,Inhibiton vector,Proliferation,Invasion

國家自然科學基金(8146039)；廣西自然科學基金(2011GXNSFA018184；2015GXNSFAA139159)

賴月華(1987～)，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤學。

姚德生(1967～)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：婦科腫瘤學，E-mail：yaodeson@163.com。

R 737.33

A

0253-4304(2016)08-1053-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.01

2016-02-25

2016-05-05)