鐘秀宏 , 張以忠 , 孫艷美 , 楊寧江 , 齊 玲 , 趙東海 ,鄭中華 , 趙麗微 , 王 爽 , 溫 娜 ， 楊淑艷

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 , 吉林吉林132013)

燈盞花素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1，Smad3表達(dá)的影響

鐘秀宏 , 張以忠 , 孫艷美 , 楊寧江 , 齊 玲 , 趙東海 ,鄭中華 , 趙麗微 , 王 爽 , 溫 娜 ， 楊淑艷

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 , 吉林吉林132013)

為了觀察燈盞花素對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中 TGF-β1和Smad3表達(dá)的影響, 探討燈盞花素抗大鼠肝纖維化的作用機(jī)制， 方法：將大鼠32只隨機(jī)分為對(duì)照組、 模型組、 水飛薊賓組和燈盞花素組， 采用皮下注射四氯化碳(CCl4)造成大鼠肝纖維化模型， 每周兩次， 連續(xù) 8 周。 留取肝左葉行 H.E.Masson染色, 免疫組化方法檢測(cè)各組TGF-β1和Smad3的表達(dá)， 然后光鏡下觀察肝組織學(xué)變化和TGF-β1和Smad3表達(dá)量。結(jié)果與對(duì)照組比較， 模型組TGF-β1和Smad3的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，和模型組比較， 燈盞花素可顯著減少TGF-β1和Smad3的表達(dá)(P<0.05), 而且肝纖維化減輕。 表明燈盞花素可抑制大鼠肝纖維化模型中TGF-β1和Smad3的表達(dá), 從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

燈盞花素 ; 肝纖維化 ; 肝星狀細(xì)胞 ; Smad3； TGF-β1

前期我們研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素可以抑制肝內(nèi)纖維組織形成，并明顯降低肝組織羥(基)脯氨酸含量、 MDA含量及升高 SOD 活力，推斷抗氧化損傷可能是燈盞花素抗肝纖維化作用機(jī)制之一[1]。近年來大量研究顯示[2-3]，肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟內(nèi)沉積為特征,且肝星狀細(xì)胞(HSC)活化在肝纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,抑制HSC激活以及ECM的沉積是一個(gè)非常重要的抗肝纖維化的靶點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多藥物通過干預(yù)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制HSC激活以及ECM的沉積[4]，因此，本次研究擬通過建立CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型, 觀察燈盞花素對(duì) TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響, 旨在進(jìn)一步探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制,以為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 燈盞花素片(昆明興中制藥有限責(zé)任公司)；水飛薊賓膠囊(天津天士力制藥股份有限公司)；使用時(shí)用生理鹽水溶解，配制相應(yīng)濃度；四氯化碳(CCl4，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；試驗(yàn)前用滅菌精制花生油配成 40% 濃度；CCl4(分析純，西安化學(xué)試劑廠，批號(hào)：090106)；SABC 盒、DAB顯色試劑盒和 兔抗大鼠Smad3、TGF-β1多克隆抗體均購(gòu)自武漢博士德生物制品有限公司；ZMN-7803 型全自動(dòng)組織包埋機(jī)(常州市華利電子有限公司)；RM2126 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；BA300 型數(shù)碼生物顯微鏡(中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 Wistar 大鼠(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，32只，雌雄各半，體重200±20g。清潔級(jí)，許可證號(hào):SCXK(吉)2008-0005。環(huán)境溫度為(23±1)℃，相對(duì)濕度為40%。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 將大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為：對(duì)照組，模型組，水飛薊賓組，燈盞花素組，每組8只。對(duì)照組給予生理鹽水，其余3組建立肝纖維化模型。

1.3.2 造模及給藥 除對(duì)照組外，其余3組大鼠背部皮下注射40% CCl41.5 mL/kg，每周兩次，首次劑量加倍，造成肝纖維化模型。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。其余5 d 水飛薊賓和燈盞花素組分別以水飛薊賓 150 mg/kg和燈盞花素 80 mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組分別以生理鹽水灌胃，各組灌胃體積相同，連續(xù)8周，第8周末處死大鼠。

1.3.3 標(biāo)本制作 取肝臟左葉，于10%中性緩沖福爾馬林液中固定，固定的肝臟組織包埋制作蠟塊, 常規(guī)切片,厚度為4 μm。

1.3.4 肝臟病理形態(tài)學(xué)觀察 組織切片H.E.常規(guī)和Masson染色。肝纖維化程度分期標(biāo)準(zhǔn)[5]：0級(jí)：正常肝臟，未見肝纖維化；Ⅰ級(jí)：包括匯管區(qū)、匯管區(qū)周圍纖維化和限局竇周纖維化或小葉內(nèi)纖維瘢痕，二者均不影響小葉結(jié)構(gòu)的完整性；Ⅱ級(jí)：可見纖維間隔即橋接纖維化，雖有纖維間隔形成，但是小葉結(jié)構(gòu)大部分保留；Ⅲ級(jí)：大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但是尚無肝硬化；Ⅳ級(jí)：早期肝硬化，肝實(shí)質(zhì)廣泛破壞，彌漫性纖維增生，被分隔的肝細(xì)胞團(tuán)呈不同程度的再生及假小葉形成。

1.3.5 肝臟免疫組織化學(xué)檢測(cè) 組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟脫水, 3% H2O2室溫孵育10 min,以去除內(nèi)源性過氧化物酶, 蒸餾水洗, 將切片于 0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液中微波煮沸修復(fù)10 min, 馬血清封閉非特異性抗原, 分別滴加兔抗大鼠多克隆抗體TGF-β1(1∶100)、Smad3(1∶200) 50 μL, 以 PBS緩沖液代替 Ⅰ抗作為陰性對(duì)照, 4 ℃冰箱過夜, PBS洗 3 min×3次, 滴加生物素化羊抗兔抗體IgG, 辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液進(jìn)行反應(yīng), 用新鮮配置的 DAB顯色, 顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間, 終止反應(yīng), 蒸餾水洗, 蘇木素復(fù)染, 鹽酸乙醇分化, 脫水,透明, 中性樹膠封片, 光鏡下觀察TGF-β1、smad3表達(dá)情況。

免疫組化結(jié)果：根據(jù)細(xì)胞染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評(píng)定[6]:基本不著色者為0分,著色淡黃者為1分, 棕黃者為2分, 棕褐者為3分; 著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率: 5%以下為0分, 6%～25%為1分, 26%～50%為 2分, >51%為3分。將每張切片染色程度與染色細(xì)胞百分率得分各自相乘,為其最后得分。0 分為(- ),1～3分為 (+),4～6 分為(++),7～9 分為(+++)。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無纖維組織增生(見中插彩版圖1A)；模型組大鼠肝組織中肝索排列紊亂, 可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死, 伴少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 肝細(xì)胞空泡變性散在分布, 間質(zhì)增生明顯, 膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔形成, 其破壞界板, 分割、包繞肝小葉, 形成較為完整的假小葉(見中插彩版圖1B)；燈盞花素組和水飛薊賓組大鼠肝組織肝小葉多呈放射狀分布, 膠原纖維間隔較少, 肝細(xì)胞壞死、 炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少見, 匯管區(qū)結(jié)締組織增生不明顯(見中插彩版圖1C、D)。

各組大鼠肝纖維化分級(jí)比較,模型組肝纖維化分級(jí)顯著重于正常組( 與正常組比較,P<0.05 ), 燈盞花素組和水飛薊賓組可以顯著減輕模型大鼠肝纖維化(與模型組比較, 均P<0.05 ), 燈盞花素組和水飛薊賓組兩兩比較差異無顯著性意義(P>0.05 )見表1。

表1 各組大鼠肝組織肝纖維化程度比較

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05，下表同

2.2 TGF-β1和smad3免疫組化結(jié)果

2.2.1 TGF-β1免疫組化結(jié)果 TGF-β1主要在細(xì)胞漿內(nèi)，其次是細(xì)胞膜。正常組大鼠肝組織在正常肝細(xì)胞內(nèi)幾乎無表達(dá),肝竇間隙、匯管區(qū)基質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有少量表達(dá)。模型組肝內(nèi)TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng),主要見于小葉周圍擴(kuò)大的纖維組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞、竇周細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及增生的膽小管周圍梭狀細(xì)胞內(nèi),肝細(xì)胞內(nèi)無表達(dá)。TGF-β1表達(dá)的陽性強(qiáng)度明顯高于正常組(P<0.05)；燈盞花素組和水飛薊賓組大鼠陽性染色程度較模型組明顯減輕,主要表達(dá)集中在匯管區(qū)、間質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。燈盞花素和水飛薊賓可以顯著減少肝纖維化大鼠TGF-β1的陽性表達(dá), 燈盞花素組和水飛薊賓組與模型組比較差異有顯著性意義(均P<0.05)。大鼠肝組織TGF-β1陽性表達(dá)結(jié)果比較見表2；免疫組化結(jié)果見中插彩版圖2。

表2 大鼠肝組織TGF-β1陽性表達(dá)結(jié)果比較

2.2.2 Smad3免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組肝組織幾乎無表達(dá), 僅在匯管區(qū)基質(zhì)及間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)極微量表達(dá)。模型組Smad3 表達(dá)明顯增強(qiáng),陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。Smad3主要分布于纖維間隔、匯管區(qū)、門靜脈、中央靜脈、肝小葉周圍和竇壁周圍的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,以纖維間隔為主。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Smad3表達(dá)的陽性強(qiáng)度明顯高于正常組(P<0.05);燈盞花素組和水飛薊賓組Smad3在肝組織內(nèi)的表達(dá)量減少, 陽性表達(dá)集中在匯管區(qū)和門靜脈、中央靜脈周圍。燈盞花素和水飛薊賓可以顯著減少肝纖維化大鼠Smad3的陽性表達(dá),與模型組比較差異有顯著性意義(均P<0.05)。 各組大鼠肝組織Smad3陽性表達(dá)結(jié)果比較見表3；免疫組化結(jié)果見中插彩版圖3。

表3 大鼠肝組織Smad3陽性表達(dá)結(jié)果比較

3 討論

肝纖維化(hepatic fibrosis)是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)，是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成和降解失衡造成的以ECM沉積為特點(diǎn)的疾病。在這一病理過程中，細(xì)胞與細(xì)胞因子及基質(zhì)之間相互作用，使肝臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，在竇周間隙過度沉積，繼之肝竇毛細(xì)血管纖維化，造成在肝臟內(nèi)沉積過多，最后導(dǎo)致肝纖維化。

近年來隨著對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)研究的加深, TGF-β/Smad在器官纖維化中的作用逐漸引起了人們的重視。TGF-β1 與 HSC 膜 Tβ2R 受體(TGF-β2receptor，Tβ2R)結(jié)合，并磷酸化 Tβ1R，活化的Tβ1R 再磷酸化激活 Smad(1，2，3，5，8)某一成員，其中磷酸化的Smad2，Smad3 能誘導(dǎo) Tβ1R/Smad 復(fù)合物形成[7]，致使HSC 活化為成肌纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFB)，MFB進(jìn)一步受到刺激，可合成和分泌大量ECM，并抑制其降解，而HSC 又以自分泌和旁分泌方式，上調(diào) TGF-β1的表達(dá)，加速肝纖維化的進(jìn)展[8]。因此，以 TGF-β/Smad 通路為靶點(diǎn)的抗肝纖維化治療，已成為藥物開發(fā)的一個(gè)新熱點(diǎn)[9]。本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組肝纖維化大鼠肝組織中 TGF-β1、Smad3陽性表達(dá)明顯，而與模型組比較，給予燈盞花素后，肝臟組織中內(nèi)源性 Smad3和TGF-β1表達(dá)減少，形態(tài)學(xué)觀察肝損傷和肝纖維化程度也減輕。上述提示，燈盞花素可通過抑制內(nèi)源性 Smad3蛋白表達(dá)，減弱了肝星狀細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止膠原蛋白等ECM合成來發(fā)揮其抗肝纖維化作用。

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2015-12-18

吉林市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201032242)

鐘秀宏(1971-)，女，副教授，碩士，主要從事中藥肝損傷防護(hù)研究,E-mail：xhzhong0611@163.com

楊淑艷,E-mail:xhzhong0611@163.com

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0529-6005(2016)12-0105-03