閻國(guó)強(qiáng) ， 舒 熊 ， 劉莉莉 ， 趙丹慧， 謝富強(qiáng)

(1. 北京市創(chuàng)傷骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京積水潭醫(yī)院， 北京西城100035；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京海淀100193)

Micro-CT分辨率對(duì)松質(zhì)骨微觀結(jié)構(gòu)測(cè)量的影響

閻國(guó)強(qiáng)1,2， 舒 熊1,2， 劉莉莉2， 趙丹慧1,2， 謝富強(qiáng)3

(1. 北京市創(chuàng)傷骨科研究所， 北京西城100035; 2. 北京積水潭醫(yī)院， 北京西城100035；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院， 北京海淀100193)

目的：探索Micro-CT在研究小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)時(shí)的最適分辨率。方法：Micro-CT掃描正常小鼠股骨得到松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)參數(shù), 掃描分辨率為5 μm，通過(guò)對(duì)合并像素點(diǎn)將分辨率降低至10 μm到50 μm，分別測(cè)量不同分辨率下松質(zhì)骨標(biāo)本的結(jié)構(gòu)參數(shù)，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較結(jié)構(gòu)參數(shù)在不同分辨率下的差異。結(jié)果：隨著分辨率從5 μm到50 μm按5 μm一個(gè)梯度的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，Tb.Th和Tb.Sp呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而SMI和DA的變化趨勢(shì)不明顯。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分別在40 μm、20 μm和10 μm時(shí)與對(duì)照組出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Tb.Th和Tb.Sp也分別在25 μm和50 μm時(shí)出現(xiàn)顯著性差異，BV/TV、SMI和DA未出現(xiàn)顯著性差異。結(jié)論：該試驗(yàn)證實(shí)了不同分辨率對(duì)Micro-CT測(cè)量小鼠松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)有顯著影響。Tb.Pf對(duì)分辨率的變化敏感度很高，最合適分辨率為5 μm；若不考慮Tb.Pf，其余七個(gè)參數(shù)的最合適分辨率是20 μm。

小鼠；松質(zhì)骨；Micro-CT；結(jié)構(gòu)參數(shù)；分辨率

傳統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)在評(píng)價(jià)骨組織微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)方面有很多不足。因?yàn)樗少|(zhì)骨的主要特點(diǎn)在于其骨結(jié)構(gòu)的多孔性[1-3]，而骨小梁的結(jié)構(gòu)如只能顯示很小一部分的組織形態(tài)，且只是在二維(two dimension, 2D)層面做出診斷，不能確切地描述骨小梁的三維立體結(jié)構(gòu)。

近年來(lái)微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-computed tomography, Micro-CT)在科學(xué)研究中的應(yīng)用日趨廣泛，如骨骼、牙齒和生物材料等領(lǐng)域[4]。和其他檢測(cè)手段相比，Micro-CT的獨(dú)到之處在于，能夠以非常高的分辨率對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)，不破壞檢測(cè)對(duì)象的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[5]。

伴隨Micro-CT在松質(zhì)骨小梁的分辨率的要求也越來(lái)越高(幾微米到亞微米級(jí))。而使用高分辨率的直接結(jié)果就是圖片像素高，占用存儲(chǔ)空間大。當(dāng)使用軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，一個(gè)標(biāo)本往往要花數(shù)個(gè)小時(shí)甚至十幾個(gè)小時(shí)，導(dǎo)致分析的效率顯著下降。為了解決這個(gè)問(wèn)題，本試驗(yàn)采用原始高分辨率圖像通過(guò)合并像素點(diǎn)降低分辨率后再進(jìn)行分析，尋求最適合的分析分辨率，以達(dá)到既不影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，又能大大節(jié)省分析數(shù)據(jù)的時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本準(zhǔn)備

SPF級(jí)C57雌性小鼠5只，體重(18～25)g，3月齡。均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(京)2013-0011]，飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF屏障設(shè)施[SYXK(京)2012-0027]內(nèi)的IVC籠盒內(nèi)，個(gè)體自由取水和飼料，24 h恒溫恒濕。室溫維持在(25±2)℃，濕度保持在(55±5)%，每天保持12 h的晝夜循環(huán)。

適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，麻醉并實(shí)施安樂(lè)死術(shù)，取左側(cè)后肢去除軟組織后，將股骨置于福爾馬林中固定。掃描前將標(biāo)本從福爾馬林中取出并置于生理鹽水中過(guò)夜。所有操作符合實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求。

1.2 Micro-CT掃描

將左側(cè)股骨放置于圓柱形的聚丙烯掃描杯中，使用Micro-CT(SKYSCAN 1172，Belgium)掃描，掃描范圍是股骨遠(yuǎn)端1/3部分。掃描參數(shù)包括：球管電壓45 kv；電流165 μA；曝光時(shí)間500 ms；旋轉(zhuǎn)角度和步長(zhǎng)分別是180°和0.4°；采用0.5 AL的filter；掃描分辨率為5 μm。掃描完畢后，采用設(shè)備自帶的重構(gòu)軟件NRecon(V1.6.9.4)對(duì)掃描圖像進(jìn)行重構(gòu)得到立體分辨率為5 μm的bmp圖像。

使用CTan(V1.14.4)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，興趣區(qū)域(Region of Interest,ROI)為股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板上方100層至500層(共401層，見(jiàn)圖1)，厚度為2 005 μm的皮質(zhì)骨內(nèi)側(cè)松質(zhì)骨。將原始圖像的分辨率按5 μm一個(gè)梯度降低，得到每個(gè)標(biāo)本5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm的圖像。本試驗(yàn)中按分辨率共分10個(gè)組，其中5 μm組為對(duì)照組。通過(guò)Micro-CT自帶的軟件CTan計(jì)算8個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)(BV/TV、BS/BV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Pf、SMI和DA)(見(jiàn)表1)。

表1 小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖1 小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁ROI選取范圍(以生長(zhǎng)板為基準(zhǔn)線)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。比較不同的分辨率組和對(duì)照組(5 μm)之間的差異。在此方法中，圖像分辨率的改變是一個(gè)被處理因素，采用單因素方差分析進(jìn)行比較,當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有顯著意義；當(dāng)P<0.01時(shí)，差異有極顯著意義。

2 結(jié)果

從小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁的立體圖中可看到(見(jiàn)圖2)，隨著分辨率的降低，骨小梁丟失逐漸增加，同時(shí)伴隨分辨率的降低，各結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化不盡相同。 在本試驗(yàn)中，隨著分辨率的降低，BV/TV、BS/BV、Tb.N和Tb.Pf呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，Tb.Th和Tb.Sp呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而SMI和DA的變化趨勢(shì)不明顯。BS/BV、Tb.N和Tb.Pf分別在40 μm、40 μm和10 μm時(shí)與對(duì)照組出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Tb.Th和Tb.Sp也分別在25 μm和50 μm時(shí)出現(xiàn)顯著性差異見(jiàn)圖2。而在本試驗(yàn)中，隨著分辨率降低，BV/TV、SMI和DA未出現(xiàn)顯著性差異。Tb.Pf對(duì)分辨率的變化敏感度很高，最適分辨率為5 μm；若不考慮Tb.Pf，其余7個(gè)參數(shù)的最適分辨率是20 μm(見(jiàn)表2)。

圖2 小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁立體圖(5 μm、10 μm、15 μm、20 μm、25 μm、30 μm、35 μm、40 μm、45 μm、50 μm)

圖3 各結(jié)構(gòu)參數(shù)隨分辨率降低的變化趨勢(shì)
(*:P<0.05， **:P<0.01)

表2 各結(jié)構(gòu)參數(shù)適用的分辨率范圍

3 討論

Micro-CT是一臺(tái)精密儀器，可用于骨科學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域。有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Micro-CT得出的結(jié)構(gòu)參數(shù)都對(duì)分辨率有強(qiáng)烈的依賴性[6]。但高精度的掃描數(shù)據(jù)導(dǎo)致掃描和重建的數(shù)據(jù)量龐大，分析時(shí)間耗費(fèi)巨大。例如在本試驗(yàn)中，使用Micro-CT進(jìn)行小鼠股骨遠(yuǎn)端分辨率為5 μm掃描并重建后的數(shù)據(jù)約占用硬盤(pán)空間12GB，而對(duì)這一數(shù)據(jù)進(jìn)行CTan軟件分析時(shí)，一個(gè)樣本則耗時(shí)近10個(gè)小時(shí)，而這只是一個(gè)樣本的數(shù)據(jù)。若進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析時(shí)，不論是對(duì)數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存空間還是分析時(shí)間，都是一個(gè)難題。所有我們推測(cè)，在理論上存在一個(gè)臨界分辨率，采用此臨界分辨率，既不影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，又能大大節(jié)省分析數(shù)據(jù)的時(shí)間。

Perilli E[7]曾做過(guò)關(guān)于關(guān)于人腰椎結(jié)構(gòu)參數(shù)隨著分辨率變化的試驗(yàn)，他采用17 μm，34 μm，68 μm三個(gè)分辨率對(duì)骨小梁的BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和SMI這5個(gè)參數(shù)進(jìn)行比較分析，隨分辨率降低的變化趨勢(shì)和本試驗(yàn)基本一致，但都在分辨率降低一倍時(shí)，即34 μm時(shí)都出現(xiàn)了顯著差異或極顯著差異。而本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BV/TV、SMI對(duì)分辨率的變化不敏感，即在10-50 μm范圍內(nèi)未出現(xiàn)顯著差異，且Tb.Th、Tb.Sp和Tb.N分別在25 μm、50 μm和40 μm時(shí)出現(xiàn)顯著差異，即他們分別是在5倍、10倍和8倍最高分辨率時(shí)出現(xiàn)顯著差異。差異的原因可能有以下幾點(diǎn)：一、動(dòng)物間的種屬差異。本試驗(yàn)采用的C57小鼠屬于近交系，個(gè)體差異很小。相比之下，人類脊柱的椎體骨小梁之間的差異會(huì)略大；二、機(jī)器型號(hào)的差異。本試驗(yàn)使用的機(jī)器是專門(mén)用來(lái)掃描離體樣本的Micro-CT 1172，而Perilli E所使用的MIcro-CT 1076主要適用于活體樣本的掃描。對(duì)離體樣本來(lái)說(shuō)，兩者在分辨率和精確性上差異較大；三、骨小梁厚度的差異。正常小鼠骨小梁厚度約30～40 μm，而人類骨小梁的厚度約80～120 μm。本試驗(yàn)中可看到，隨著分辨率的降低，骨小梁丟失逐漸增加。同時(shí)伴隨分辨率的降低，各結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化不盡相同。但分辨率在20 μm時(shí)，除Tb.Pf外的七個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)并未表現(xiàn)出顯著差異。因此，本試驗(yàn)認(rèn)為當(dāng)無(wú)Tb.Pf時(shí)，進(jìn)行正常小鼠骨小梁分析時(shí)的最適分辨率為20 μm。

當(dāng)然，本試驗(yàn)尚存在一些不足之處。由于電腦運(yùn)行速度的影響因素較多，如電腦配置、溫濕度、電腦運(yùn)行時(shí)間等，本試驗(yàn)未對(duì)各分辨率節(jié)省的時(shí)間做統(tǒng)計(jì)分析。另外，未對(duì)有骨質(zhì)疏松的小鼠進(jìn)行比較。下一步我們將分析不同的骨小梁結(jié)構(gòu)和動(dòng)物種屬與分辨率之間的關(guān)系。

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Theeffect of micro-CT resolution on measuring microstructure parameters of trabecular Bone

YAN Guo-qiang1, SHU Xiong1, LIU Li-li2, ZHAO Dan-hui1,XIE Fu-qiang3

(1. Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035 China; 2. Beijing Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing 100035, China; 3.College of Veterinary Medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China)

To explore the optimal resolution of Micro-CT in the study of the structural parameters of trabecular bone in mice.The trabecular bone of mice was scanned by micro-CT with the scanning resolution of 5μm, decreasing the resolution to 10μm ～50μm through the study of the multiplication of resolution so as to obtain the reduced-resolution micro-CT data. Then, the microstructural parameters were calculated by these images. Then the differences of structural parameters by these micro-CT data of different resolution were analyzed. Different parameters had different correlations with variations of the resolution. The value of BV/TV, BS/BV, Tb.Th and Tb.Pf declined, while the value of Tb.Pf and Tb.Sp increased when decreasing the resolution. In addition, there was no effect on the SMI and DA with variations of the resolution. BS/BV, Tb.N and Tb.Pf had statistically significant difference in 40μm, 20μm and 10μm compared with control group, respectively. Tb.Th and Tb.Sp had significant difference respectively in 25μm and 50μm, and BV/TV, SMI and DA had no significant difference. There is a significant effect of different resolutions on the accuracy of the micro-CT, when measuring the microarchitectural parameters of the trabecular bone. The change of Tb.Pf resolution sensitivity is high, the most suitable resolution was 5μm; without considering Tb.Pf, the most appropriate resolution of the remaining seven parameters is 20μm.

Mice; Trabecular bone; Micro-CT; Architectural parameters; Resolution

s:ZHAO Dan-hui; XIE Fu-qiang

2016-11-15

閻國(guó)強(qiáng)(1982—)，男，技師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物影像學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，E-mail：117629867@qq.com

趙丹慧，E-mail：zhaodanhui@263.net；謝富強(qiáng)，E-mail：xiefuqiang@cau.edu.cn

S858.32

A

0529-6005(2016)12-0063-03