王 琴 ， 范學(xué)政 ， 徐 璐 ， 趙啟祖 ， 張乾義 ， 鄒興啟 ， 朱元源 ， 楊勁松 ， 寧宜寶

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)對我國不同豬瘟病毒流行毒株的免疫保護(hù)研究

王 琴 ， 范學(xué)政 ， 徐 璐 ， 趙啟祖 ， 張乾義 ， 鄒興啟 ， 朱元源 ， 楊勁松 ， 寧宜寶

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京海淀100081)

為再評價豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力，采用近年在我國流行的不同臨床致病力和不同基因亞型的9株豬瘟病毒流行毒株，進(jìn)行免疫保護(hù)效力研究。結(jié)果表明，以C-株疫苗種毒生產(chǎn)的豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)對我國目前流行的豬瘟病毒高、中、低致病力毒株及不同基因亞型(1.1、2.1、2.2)流行毒株均具有堅強(qiáng)的保護(hù)力，且免疫豬接種不同流行毒株毒后不排毒。研究結(jié)果為我國繼續(xù)使用豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行全面免疫提供了重要科學(xué)依據(jù)。

豬瘟活疫苗；豬瘟病毒；基因亞型；免疫效力

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病，是OIE規(guī)定的必需報告的疫病，也是我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020)》和《全國獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》確定優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范重大動物疫病之一。豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV, C-Strain)是目前世界公認(rèn)最安全有效的豬瘟疫苗株，先后被亞、歐和南美幾十個國家廣泛應(yīng)用，在全球CSF防控中起著重要的作用。我國目前采取以免疫為主的綜合防控策略，養(yǎng)豬業(yè)十分重視CSF的免疫，但是一些豬場免疫效果卻不理想[1]。針對這種狀況，采用近年來在我國流行的高、中、低不同致病力，分屬1.1、2.1和2.2基因亞型的CSFV進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗，對豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫保護(hù)力進(jìn)行再評價研究，以分析其免疫有效性。

1 材料與方法

1.1 豬瘟活疫苗和標(biāo)準(zhǔn)石門強(qiáng)毒株 豬瘟活疫苗(STTM傳代細(xì)胞源)(批號20100402)，廣東永順生物制藥有限公司產(chǎn)品，每頭份病毒含量>7500個兔體感染量。標(biāo)準(zhǔn)石門強(qiáng)毒血毒(SM，F(xiàn)114，1998.6.28)，國家豬瘟參考實(shí)驗室保存。

1.2 試驗用豬瘟流行毒株 從我國CSFV流行毒株庫[2-3]中篩選9株流行株(GDGZ1/95、HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJCY1/96、BJTX3/96、JL1/94、GXBH1/98、HeNXH2/98、FJFQ1/99)，病毒滴度、致病力和E2基因分等毒株信息見表1。

1.3 試驗用豬 66頭30日齡長白斷奶仔豬，購自河北保定山區(qū)。經(jīng)檢測為CSFV、PRRSV、PRV、PRRSV和PRV抗原抗體陰性。實(shí)驗前進(jìn)行為期一周的驅(qū)蟲和觀察，確保健康后使用。

1.4 試驗分組 試驗用豬按毒株分為9組，每組6頭，其中3頭免疫1頭份豬瘟活疫苗，另3頭不免疫，免疫14 d后用不同毒株攻毒(攻毒當(dāng)日記為0dpi)；第10組為石門標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株攻毒對照組；第11組(3頭)為疫苗免疫對照組；第12組(3頭)為陰性對照組。攻毒劑量見表1。

表1 試驗分組及豬瘟流行毒株背景信息

1.5 體溫和臨床記分 免疫后每天兩次對實(shí)驗豬進(jìn)行體溫測定和臨床記分[4]，其數(shù)據(jù)按免疫攻毒組、疫苗對照、陰性對照、石門攻毒對照、強(qiáng)、中和低致病力毒株攻毒對照等7組匯總分析。

1.6 免疫攻毒后排毒檢測 在免疫14 d后攻毒，每周采取1～10個免疫組和攻毒對照組豬的前腔靜脈血和扁桃體，采用CSFVTaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法進(jìn)行病毒排毒跟蹤檢測[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫與攻毒豬的體溫和臨床記分 免疫后每天兩次對實(shí)驗豬進(jìn)行體溫測定，結(jié)果免疫攻毒組、免疫組和陰性對照組體溫一直保持正常，維持在(39.5±0.5) ℃；石門攻毒組攻毒后1 dpi體溫明顯上升，之后高熱稽留41 ℃，6 dpi回落至39.5 ℃，7 dpi瀕死；強(qiáng)致病力毒株攻毒后大部分豬與石門株相似，1 dpi體溫上升，之后上升至41.5 ℃，直到21 dpi瀕死前回落至39 ℃；中等致病力毒株攻毒后5 dpi體溫正常，6 dpi～10 dpi呈上升趨勢，11 dpi～26 dpi高熱稽留41.5 ℃，瀕死前回落至39.5 ℃；低致病力毒株攻毒后，除3 dpi～6 dpi一過性發(fā)熱至(0.5-1) ℃，之后一直保持正常。體溫曲線見中插彩版圖1A。免疫攻毒、免疫和陰性對照臨床記分為0，將石門攻毒組、強(qiáng)、中和低致病力毒株4組取其臨床記分算術(shù)平均值，石門攻毒組攻毒后1 dpi小于2，2 dpi～7 dpi為4～22分，7 dpi達(dá)最高值22分；強(qiáng)致病力毒株對照組攻毒后0 dpi～2 dpi小于2，3 dpi～22 dpi為5～20分，10 dpi達(dá)21分；中等致病力毒株對照組攻毒后1 dpi～5 dpi少于5分，6 dpi～10 dpi為5～15分，11 dpi～26 dpi在15分，34 dpi達(dá)20分；低致病力毒株攻毒后，3 dpi～6 dpi臨床記分略有增加，但皆小于3，之后一直為0分。臨床記分見中插彩版圖1B。

2.2 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)對流行毒株的免疫效力 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)對強(qiáng)、中、低致病力的9個CSFV流行毒株(不同基因亞型1.1、2.1、2.2)均具有堅強(qiáng)保護(hù)效力，免疫組100%保護(hù)，對標(biāo)準(zhǔn)石門強(qiáng)毒株也表現(xiàn)100%免疫效力，所有免疫豬攻毒后未表現(xiàn)任何臨床癥狀。而攻毒對照組根據(jù)毒株致病力特征均表現(xiàn)出不同的CSF臨床癥狀。

2.3 免疫攻毒后排毒檢測 其數(shù)據(jù)按免疫攻毒組、疫苗對照、陰性對照、石門攻毒對照、強(qiáng)、中和低致病力CSFV攻毒對照7組匯總分析，9株流行毒株按照臨床致病力高、中和低分為3組和石門株數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果10個免疫攻毒組均檢測不到病毒核酸；疫苗組和陰性對照組也一直檢測不到核酸；石門強(qiáng)毒株和強(qiáng)致病力毒株攻毒豬攻毒后 1 dpi～21 dpi，平均Ct值從23.21下降到14.83；中等致病力毒株從4 dpi～34 dpi，平均Ct值從26.5下降到14.65；低致病力毒株攻毒后，除3 dpiCT值為27.8，6 dpi為28.37外，從10 dpi一直到試驗結(jié)束Ct值一直保持在30～33。核酸載量變化曲線見中插彩版圖2。表明疫苗能夠完全保護(hù)不同致病力毒株的攻擊且不排毒。

3 討論

根據(jù)對臨床上分離到的流行毒株致病特性研究，證實(shí)我國CSFV高、中和低臨床致病力毒株均有流行，低致病力毒株導(dǎo)致的種豬帶毒現(xiàn)象，是免疫失敗的原因之一[3]。CSFV分子流行病學(xué)研究對闡明病毒遺傳變異特征和規(guī)律，監(jiān)測現(xiàn)行使用疫苗的有效性，提供防控策略具有重要的科學(xué)意義。國際上根據(jù)公認(rèn)的CSFV E2基因主要抗原區(qū)域序列分析將其分為3個基因型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型)，10個基因亞型(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3和3.4)[6]。通過對來自我國31個省728條CSFV E2基因相同區(qū)域序列分析，中國流行的CSFV分屬2.1、2.2、2.3和1.1四個基因亞型，近年基因Ⅱ型成為我國優(yōu)勢流行毒株(73.82%)，其次是基因Ⅰ型(26.18%)[7]，尚未監(jiān)測到基因Ⅲ型。由于C-株種毒為基因1.1亞型，有報道推測疫苗對當(dāng)前流行的基因Ⅱ型毒株不能提供有效保護(hù)[8]，為此本研究開展了豬瘟疫苗對我國不同流行毒株的免疫保護(hù)相關(guān)性再評價，由于9個流行毒株臨床致病力不同，對豬致死劑量不同，在本研究中采用了不同攻毒感染劑量。結(jié)果表明，采用以C-株疫苗種毒生產(chǎn)的豬瘟活疫苗，對我國目前流行的不同基因亞型(1.1、2.1、2.2)的高、中、低不同臨床致病力毒株均具有堅強(qiáng)的保護(hù)力，與之前的研究相符[9]。在本研究使用的攻毒株中，采用了1株與疫苗株E2基因主要抗原區(qū)域同源性最低(81.7%)的流行毒株HeNBY1/96(2.1)，豬瘟活疫苗也能對其產(chǎn)生完全保護(hù)。盡管如此，持續(xù)開展我國CSFV流行毒株與疫苗株E2基因相同區(qū)域的監(jiān)測和比較分析對監(jiān)測疫苗的有效性非常重要，一旦發(fā)現(xiàn)與疫苗株E2基因相同區(qū)域序列同源性低于該比例的流行毒株，應(yīng)及時開展疫苗株對該流行毒株的保護(hù)效力試驗，以確定流行毒株是否變異至疫苗對其不能產(chǎn)生保護(hù)。研究還表明豬瘟活疫苗免疫抗體甚至可持續(xù)至578 dpv[10]仍然高于85%。英國AHVLA采用3.3亞型泰國CBR94/2毒株和2.1亞型UK2000毒株進(jìn)行C株疫苗免疫保護(hù)試驗，不但證明C株疫苗有效，還證實(shí)了C株疫苗能在早期快速(72 h)產(chǎn)生保護(hù)并且可以用于緊急免疫[11]。

表2 豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)免疫攻毒保護(hù)效果

綜上，豬瘟兔化弱毒疫苗依然是一株優(yōu)秀疫苗，能有效預(yù)防國際上流行的3個基因型毒株引起的CSF，澄清了CSF防控中“由野毒株變異引起免疫失敗”的觀點(diǎn)，為我國繼續(xù)使用豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行全面免疫提供了重要科學(xué)依據(jù)。

[1] 王澤洲,張東,張永寧,等. 四川省部分種豬場豬瘟血清抗體的檢測[J]. 四川畜牧獸醫(yī),2002,29(4):24-25.

[2] 王琴,涂長春,黃保續(xù),等. 豬瘟病毒分子流行病學(xué)信息系統(tǒng)的建立與應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(11):2363-2369.

[3] 王琴,寧宜寶,趙耘,等. 9株豬瘟分離毒株的致病特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報,2007,27(2):145-149.

[4] Mittelholzer C,Moser C,Tratschin J-D,etal. Porcine cells persistently infected with classical swine fever virus protected from pestivirus-induced cytopathic effect[J]. Journal of general virology， 1998,79:2981-2987.

[5] 劉俊,王琴,范學(xué)政,等. 豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(12):4366-4371.

[6] Paton D J,McGoldrick A,Greiser-Wilke I,etal. Genetic typing of classical swine fever virus[J]. Vet Microbiol，2000,73:137-157.

[7] 王琴,涂長春. 豬瘟[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2015.

[8] Zhang H,Leng C,Feng L,etal. A new subgenotype 2.1d isolates of classical swine fever virus in China,2014[J]. Infect,Genet Evol，2015,34:94-105.

[9] 丘惠深,朗洪武,王在時. 豬瘟兔化弱毒疫苗與我國近年豬瘟野毒的免疫保護(hù)相關(guān)性試驗[J].中國獸藥雜志,1997,3(3):1-3.

[10] 熊丁杰,范學(xué)政,徐璐,等. 不同劑量的豬瘟活疫苗單次免疫效果評價及疫苗存留試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2011,47(8):3-6.

[11] Simon P. Graham,Helen E，etal. Challenge of pigs with classical swine fever viruses after c-strain vaccination reveals remarkably rapid protection and insights into early immunity[J]. PLoS ONE,2012,7:1-9.

Evaluation of CSF live vaccine(ST cell line)Efficacy against Different Epidemic Virulent CSFV Strains from China

WANG Qin, FAN Xue-zheng, XU Lu, ZHAO Qi-zu,ZHANG Qian-yi, ZOU Xing-qi, ZHU Yuan-yuan,YANG Jing-song, NING Yi-bao

(China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081, China)

To re-evaluate the efficacy of C-strain vaccine, 9 strains with different virulence and viral subgenotypes isolated from domestic pigs in China were used to study vaccine efficacy. Pigs were vaccinated with C-Strain live vaccine, and then challenged with high, moderate and low virulence belonging to different viral subgenotypes (1.1, 2.1, 2.2) at 14 days post vaccination (dpv). The vaccine provided complete protection against clinical disease caused by all of the 9 challenge strains including standard virulent strain Shimen, as expected. Viral RNA was not detected in blood and tonsil in all vaccinated pigs but the control pigs. These results indicate that C-strain is still an outstanding vaccine. The study on C-strain vaccine efficacy provides an important scientific evidence for government to use C-strain vaccine to control CSF in China.

CSF live vaccine; CSFV; Subgenotype; Efficacy

NING Yi-bao

2016-12-12

國家“十一五”科技支撐計劃(2006BAD06A18)；國家“十二五”科技支撐計劃(2015BAD12B04)

王琴(1962-)，女，研究員，博士，主要從事豬病毒病研究，E-mail:Wq551@vip.sina.com

寧宜寶，E-mail:ningyibao@sina.com

S852.65+1

A

0529-6005(2016)12-0093-03