黃吉利 羅 明 潘 捷 趙鴻聲

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430015)

持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2和Bax的影響

黃吉利 羅 明1潘 捷 趙鴻聲

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430015)

目的觀察持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)(CPM)對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。方法 36只新西蘭大白兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組，每組12只。C組兔子在術(shù)后第1天即開(kāi)始進(jìn)行CPM治療，8 h/d，連續(xù)8 w。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況。RT-PCR和Western印跡方法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡率(8.08±1.23)%相比，模型組軟骨細(xì)胞凋亡率(39.85±9.93)%顯著升高(P<0.01)；凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)，Bcl-2顯著上調(diào)。結(jié)論 CPM可通過(guò)影響兔OA膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡情況，從而改善OA病情，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)相關(guān)，為臨床上利用CPM治療OA提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細(xì)胞；凋亡

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等〔1～3〕。OA病理特征是軟骨細(xì)胞功能喪失和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解。軟骨細(xì)胞凋亡改變了軟骨基質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致基質(zhì)退化和破壞，最終導(dǎo)致OA發(fā)病。預(yù)防軟骨細(xì)胞凋亡已成為目前臨床治療OA的潛在靶標(biāo)之一〔4，5〕。已知持續(xù)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)(CPM)在OA治療中具有顯著的療效。然而，CPM治療OA的機(jī)制目前還不是很清楚。本研究擬觀察CPM對(duì)兔軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，深入研究CPM治療OA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性新西蘭大白兔36只，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔許可證：SYXK(渝)20070001；動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)20020001〕，體重2.0～2.5 kg，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、治療組，每組12只，對(duì)照組兔子僅手術(shù)切開(kāi)關(guān)節(jié)囊而不損傷關(guān)節(jié)軟骨，術(shù)后籠內(nèi)自由活動(dòng)；模型組和治療組采用Hulth方法進(jìn)行造?！?〕，模型組兔子術(shù)后籠內(nèi)活動(dòng)；治療組兔子在術(shù)后第1天即開(kāi)始進(jìn)行CPM，8 h/d，連續(xù)8 w。8 w后處死所有兔子。

1.2 軟骨細(xì)胞獲取方法 無(wú)菌條件下分離兔軟骨組織，并采用眼科剪剪碎至1～3 mm，用Hank液清洗2次，隨后加入0.25%Ⅱ型膠原酶在37℃消化1 h，采用100目孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾過(guò)液，1 500 r/min離心5 min，所得沉淀即為兔軟骨細(xì)胞。

1.3 凋亡染色方法 獲取的軟骨細(xì)胞以RPMI1640重懸并計(jì)數(shù)。采用Annexin V/7-AAD方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。具體操作方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 RT-PCR Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。得到的數(shù)據(jù)通過(guò)比較CT值法(2-△△Ct)進(jìn)行定量分析。見(jiàn)表1。

1.5 Western印跡方法 采用Novagen公司的Cytobuster提取細(xì)胞總蛋白，提取蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。次日采用0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min，加入山羊抗兔/鼠IgG的HRP標(biāo)記二抗，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，每次5 min。硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad軟件行t檢驗(yàn)。

表1 RT-PCR檢測(cè)基因及引物序列表

基因序列P53正向：5′?GGAGACATTTTCAGGCTTATGG?3′反向：5′?AGAAGGGACAAAAGATGACAGG?3′caspase?3正向：5′?GCACTGGAATGTCAGCTCGCA?3′反向：5′?GCCACCTTCCGGTTAACACGA?3′Bcl?2正向：5′?GGCATGTGCACAGCTGGAT?3′反向：5′?AGAGAGCCAGCAGAAATCAAACA?3′Bax正向：5′?TGCCAGCTGACAAGTATGCT?3′反向：5′?TATAGTGCACACGGCCTTGAG?3′U6正向：5′?GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT?3′反向：5′?CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT?3′

2 結(jié) 果

2.1 軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡率為(8.08±1.23)%，模型組為(30.19±7.21)%，治療組軟骨細(xì)胞凋亡率為(11.14±4.03)%，與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

2.2 凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組(2.56±0.62，2.15±0.46，1.85±0.06，14.56±2.23)相比，模型組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53(8.13±1.14)、caspase-3(17.5±3.23)、Bax mRNA(4.72±0.60)表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2 mRNA(1.04±0.86)表達(dá)水平顯著下調(diào)。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53(2.67±0.43)、caspase-3(4.17±0.41)、Bax mRNA(2.49±0.08)表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平(12.42±2.14)出現(xiàn)顯著上調(diào)。見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

2.3 凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡方法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

3 討 論

CPM在全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)恢復(fù)治療中療效顯著，在OA治療中也取得一定的成果〔7〕。然而關(guān)于CPM治療OA，改善OA病情的機(jī)制目前尚未完全研究清楚。軟骨細(xì)胞凋亡所致的軟骨退變?cè)贠A發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔8,9〕。那么CPM是否可通過(guò)改善軟骨細(xì)胞的凋亡情況從而改善OA病情目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究首先觀察了在CPM治療后軟骨細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，在OA模型組軟骨細(xì)胞的凋亡情況顯著升高，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的軟骨細(xì)胞凋亡是OA發(fā)病的主要原因相一致〔8,9〕。在給予CPM治療后，軟骨細(xì)胞的凋亡水平顯著降低。上述結(jié)果提示，CPM可通過(guò)改善軟骨細(xì)胞的凋亡情況，進(jìn)而改善OA病情。

細(xì)胞凋亡是由多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控的一個(gè)程序性細(xì)胞死亡過(guò)程。P53基因介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔10〕。caspase蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，其中，caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，一旦caspase-3被激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆地走向死亡〔11〕。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)基因是一種原癌基因，已知與內(nèi)在凋亡途徑密切相關(guān)〔12〕。Bax基因主要通過(guò)與Bcl-2形成同源或異源二聚體形式發(fā)揮作用，當(dāng)Bax同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)、Bcl-2的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，該結(jié)果與模型組軟骨細(xì)胞凋亡水平顯著升高相一致。而給予CPM治療后，與模型組相比，治療組軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bax表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)CPM改善兔OA病情的機(jī)制可能是改善軟骨細(xì)胞凋亡水平。CPM調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因P53、caspase-3、Bcl-2、Bax表達(dá)相關(guān)。

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〔2015-12-18修回〕

(編輯 徐 杰)

黃吉利(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)損傷研究。

R68

A

1005-9202(2016)24-6067-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.009

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院急診外科