傅杭州 方慶全

腎穿刺活檢組織病理診斷中六胺銀染色的改進(jìn)

傅杭州 方慶全

目的 探討腎穿刺活檢組織病理診斷中六胺銀染色染液配制法與染色方法改進(jìn)的可行性。方法 收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2014年1月～2015年12月確診的60例腎穿刺活檢病例的蠟塊，每例蠟塊均連續(xù)切片3片，隨機(jī)分為3組。A組使用傳統(tǒng)六胺銀染液用傳統(tǒng)染色法染色，B組使用改進(jìn)六胺銀染液用傳統(tǒng)染色法染色，C組使用改進(jìn)六胺銀染液用改進(jìn)染色法染色，以百分制評(píng)定180張六胺銀染色片的得分，統(tǒng)計(jì)各組的得分，結(jié)果采用（x-±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，分析各組的得分差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 B組染色得分高于A組染色得分（82．3±10．4 vs． 68．3±9．8，t=7．592，P＜0．001）；C組染色得分高于B組染色法得分（93．6±6．7 vs． 82．3±10．4，t=7．076，P＜0．001）。結(jié)論 改進(jìn)六胺銀染液配制方法及改進(jìn)其染色方法，結(jié)果顯示基底膜、網(wǎng)狀纖維呈黑色，且界限清晰，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景粉紅色，清晰無(wú)雜質(zhì)，優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

腎穿刺活檢組織；六胺銀染色；改進(jìn)

醫(yī)學(xué)發(fā)展的歷史證明，僅從臨床癥狀和檢驗(yàn)指征進(jìn)行疾病的診斷和治療，存在一定的缺陷和局限性。將病變的器官或組織通過(guò)病理形態(tài)學(xué)方法，客觀地展現(xiàn)于醫(yī)生的視野，必能使其思維得以升華，進(jìn)而為其診斷和治療奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，所以，腎活檢的病理診斷在腎臟病學(xué)的發(fā)展歷程中，起到了不可估量的作用［1］。腎穿刺活檢組織病理診斷中，六胺銀染色法是重要的檢查方法，能清晰的顯示基底膜增厚“叮突”、“雙軌”等病理變化，還可以觀察腎小球毛細(xì)血管或球囊壁基底膜在炎性損傷中的形態(tài)學(xué)改變［2］，因此在腎穿刺活檢組織病理診斷中具有極為重要的意義。但臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)方法配制的六胺銀工作液常染色效果不理想，傳統(tǒng)的六胺銀染色法染色效果不佳，筆者對(duì)六胺銀工作液的配制方法進(jìn)行了一些改進(jìn)，對(duì)傳統(tǒng)染色法也進(jìn)行了一些改進(jìn)，均取得很好的效果。

1 資料與方法

1.1 資料

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2014年1月～2015年12月確診的60例腎穿刺活檢病例的蠟塊，每例蠟塊均連續(xù)切片3片，隨機(jī)分為3組。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)六胺銀染液配制法 取0.5 ml的5%硝酸銀溶液緩慢加入到10 ml的3%六次甲基四胺水溶液中，隨即形成乳白色沉淀，搖動(dòng)沉淀即溶解變清。再加入5%四硼酸鈉水溶液2 ml，混勻，加入蒸餾水25 ml，混勻后即可使用［3］。

1.2.2 改進(jìn)六胺銀染液配制法 2%六次甲基四胺水溶液10 ml，加入5%四硼酸鈉溶液2 ml，加入2%硝酸銀水溶液10 ml，震蕩至乳白色懸濁液變?yōu)榍辶镣该?，加?0 ml蒸餾水，混勻后過(guò)濾立即使用。

1.2.3 傳統(tǒng)六胺銀染色法 （1）切片厚1～2 μm；（2）常規(guī)脫蠟至水；（3）0.5%高碘酸溶液氧化15 min，水洗5 min；（4）8%鉻酸氧化30 min，流水稍洗；（5）1%偏重亞硫酸鈉處理1 min，流水沖洗5 min，蒸餾水洗；（6）放入預(yù)熱至60℃的六胺銀工作液作用30～60 min，見(jiàn)到切片在黃棕色的背景中有黑色反應(yīng)時(shí)，取出切片，蒸餾水洗后鏡下檢查（以腎小球毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的黑色銀沉淀為準(zhǔn)），如果著色深度不夠，可放回六胺銀工作液繼續(xù)染色；（7）蒸餾水洗后，0.1%氯化金溶液調(diào)色1～3 min；（8）蒸餾水稍洗后，硫代硫酸鈉液處理3 min，自來(lái)水沖洗5 min。（9）HE淺染3 min，分化，還藍(lán)。（10）各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固［3］。

1.2.4 改進(jìn)的六胺銀染色法 （1）切片厚1～2 μm；（2）脫蠟至水后放入60℃的Bouin固定液中1 h，流水沖洗至黃色褪去；（3） 2%高碘酸溶液氧化15 min，水洗；（4）8%鉻酸氧化30 min，流水稍洗；（5）1%偏重亞硫酸鈉處理1 min，流水沖洗5 min，蒸餾水洗；（6）放入預(yù)熱至65℃的六胺銀工作液作用30～40 min，見(jiàn)到切片在黃棕色的背景中有黑色反應(yīng)時(shí)，取出切片，蒸餾水洗后鏡下檢查，或者25 min后每3 min取出切片1次，蒸餾水洗后用顯微鏡觀察，直至腎小球毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的黑色銀沉淀為止，如果著色深度不夠，可放回六胺銀工作液繼續(xù)染色；（7）蒸餾水洗后，0.1%氯化金溶液調(diào)色1～3 min；（8）蒸餾水稍洗后，硫代硫酸鈉液處理、水洗、對(duì)比染色、脫水、透明、封固等操作步驟同傳統(tǒng)六胺銀染色法［2］。

1.2.5 染色 A組：使用傳統(tǒng)六胺銀染液用傳統(tǒng)染色法染色；B組：使用改進(jìn)六胺銀染液用傳統(tǒng)染色法染色；C組：使用改進(jìn)六胺銀染液用改進(jìn)染色法染色。

1.2.6 評(píng)片 切片由2名副主任醫(yī)師雙盲評(píng)片，每片進(jìn)行百分制評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

B組染色得分高于A組染液染色得分（82.3±10.4 vs. 68.3±9.8），t=7.592，P＜0.001。C組染色得分高于B組染色法得分（93.6±6.7 vs. 82.3±10.4），t=7.076，P＜0.001。

3 討論

改進(jìn)的六胺銀染液染色結(jié)果顯示基底膜、網(wǎng)狀纖維呈黑色，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景粉紅色，清晰無(wú)雜質(zhì)；而傳統(tǒng)的六胺銀染液染色結(jié)果基底膜常染色過(guò)深或過(guò)淺，易產(chǎn)生基底膜增厚的假象，背景易出現(xiàn)銀顆粒雜質(zhì)。改進(jìn)的六胺銀染液配制時(shí)省去配制六胺銀貯備液的步驟，亦省去儲(chǔ)存貯備液的步驟，試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，提高了試劑的穩(wěn)定性。改進(jìn)的染液降低了六次甲基四胺水溶液和硝酸銀溶液的溶度，使切片在銀染色時(shí)更易控制，可有效地避免銀染色過(guò)深、染色過(guò)淺或銀顆粒沉積。改進(jìn)染液還在六次甲基四胺與硝酸銀反應(yīng)之前，先在六次甲基四胺水溶液中加入四硼酸鈉溶液，使六次甲基四胺堿化后再加入硝酸銀，堿化的六次甲基四胺螯合銀離子的穩(wěn)定性被削弱，使銀離子更易被游離的醛基還原成棕黑色的沉淀，因此染色效果更佳。

病理常規(guī)切片厚度多為3～4 μm，而腎穿刺活檢組織六胺銀染色的切片厚度以1～2 μm為宜，切片太厚不宜觀察基底膜病變和組織結(jié)構(gòu)。因Bouin固定液對(duì)腎組織固定效果更好，所以作者在切片脫蠟至水后，將切片放入60℃的Bouin固定液中補(bǔ)充固定1 h，提高了染色效果。因?yàn)榛啄じ缓ざ嗵?，必須?jīng)過(guò)充分氧化才能使醛基暴露完全，醛基把六胺銀還原為黑色的金屬銀［4］，若氧化不夠或不完全，將導(dǎo)致切片染色較淺，影響染色結(jié)果的判斷，所以筆者將高碘酸的溶度由0.5%提高至2%，以確保充分氧化。

六胺銀工作液的染色步驟至關(guān)重要，作者經(jīng)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，將六胺銀工作液作用溫度由傳統(tǒng)的60℃改為65℃，改進(jìn)染色法染色時(shí)間縮短，組織結(jié)構(gòu)更清晰，對(duì)比度更強(qiáng)。六胺銀染色為進(jìn)行性銀浸染，所以作者見(jiàn)到切片在黃棕色的背景中有黑色反應(yīng)時(shí)，取出切片，蒸餾水洗后鏡下檢查，或者在六胺銀工作液作用25 min后每3 min顯微鏡觀察1次，如著色不夠深，可用蒸餾水沖洗后再放回六胺銀工作液中繼續(xù)作用。腎小管基底膜一般比腎血管球基底膜顯色早，但以腎小球毛細(xì)血管基底膜出現(xiàn)黑色的銀沉淀為標(biāo)準(zhǔn)，血管球基底膜呈黑色而背景呈棕黃色為宜。

氯化金溶液調(diào)色步驟往往不被重視，傳統(tǒng)染色法簡(jiǎn)單地介紹調(diào)色2 min，而調(diào)色應(yīng)以切片呈灰色，基底膜呈黑色為宜。如處理不足則在切片內(nèi)有大量未顯色的紅棕色殘存物，如果調(diào)色過(guò)度，組織將有紅色色調(diào)，影響對(duì)基底膜等纖細(xì)結(jié)構(gòu)的分辨。作者建議調(diào)色也應(yīng)在調(diào)色1 min后，在顯微鏡觀察下控制，以達(dá)到最佳效果。

筆者通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)六胺銀染液配制方法及改進(jìn)其染色方法，結(jié)果顯示基底膜、網(wǎng)狀纖維呈黑色，且界限清晰，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景粉紅色，清晰無(wú)雜質(zhì)，優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

［1］ 鄒萬(wàn)忠． 腎活檢病理學(xué)［M］． 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006：71-107．

［2］ 鐘緯經(jīng)，康凱夫． 改良PASM染色法在腎穿刺活檢組織中的應(yīng)用［J］． 診斷病理學(xué)雜志，2015，22（1）：63．

［3］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)． 臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊(cè)［M］． 北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：169-170．

［4］ 戚曉東． 腎小球基底膜PAMS染色方法的應(yīng)用體會(huì)［J］． 診斷病理學(xué)雜志，2012，19（2）：159．

Histopathological Diagnosis of Renal Biopsy Hexamine Silver Stain Improvement

FU Hangzhou FANG Qingquan Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen Fujian 361003，China

Objective To explore the histopathological diagnosis of renal biopsy hexamine silver dyeing dye solution preparation method and the feasibility of improvement methods． Methods Collected in first affiliated hospital of xiamen university from January 2014 to December 2015，60 cases of renal biopsy diagnosis of wax，each wax from 60 cases of renal biopsy diagnosis all were cut into serial sections of three and randomly divided into three groups． group A was dyed by traditional hexamine silver dye solution under the traditional dyeing method，group B，which also under the traditional dyeing method，was dyed with improved hexamine silver dye solution． Under the improved dyeing method，group C was dyed with improved hexamine silver dye solution，scores of the groups（out of a possible 100）that were 180 pieces of hexamine silver staining sections，were presented in the form of（x-±s）．Compared with the independent sample t-test，to analyze the statistical significance of the differences in each group’s scores． Results Group B had got significantly higher scores than group A（82．3±10．4 vs． 68．3±9．8，t=7．592，P＜0．001）． While the scores of group C were much higher than group B（93．6±6．7 vs． 82．3±10．4，t=7．076，P＜0．001）． Conclusion Under the improved hexamine silver dye solution preparation method and improved its dyeing method，the result shows that the basement membrane，reticular fiber in black，and clear boundaries，immune complex red，thenuclei are blue，pink background，clear and without impurities，in conclusion，the improved hexamine silver dye solution preparation method and improved dyeing method is significantly better than the traditional method．

Renal biopsy tissue，Hexamine silver stain，Improvement

R361

A

1674-9316（2016）19-0160-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．19．108

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建 廈門 361003