齊海霞 張海云 曹院章 唐艷榮 張雪梅 郭 睿

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

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馬傳染性貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測方法

齊海霞 張海云 曹院章 唐艷榮 張雪梅 郭 睿

（北京市朝陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

馬傳染性貧血病簡稱馬傳貧，是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒亞科中的馬傳染性貧血病病毒感染引起，常發(fā)生于馬、騾、驢。其特征主要為間歇性發(fā)燒、消瘦、進(jìn)行性衰弱、貧血、出血和浮腫；在無燒期間，癥狀逐漸減輕或暫時(shí)消失。患病后，病畜喪失勞動(dòng)力，且成為新的傳染源，重者導(dǎo)致死亡，對養(yǎng)馬業(yè)造成嚴(yán)重危害，是各動(dòng)物疫病防控單位每年春秋兩次檢疫工作中的重中之重。

馬傳貧目前常用的檢測方法為補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)、斑點(diǎn)試驗(yàn)3種，其中，又以瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)試驗(yàn)最為經(jīng)濟(jì)實(shí)用和準(zhǔn)確，是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最多的方法，筆者結(jié)合多年積累的檢測經(jīng)驗(yàn)介紹檢測細(xì)節(jié)及注意事項(xiàng)，供實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員參考。

方法遵循《馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法》（NY/T 569-2002）。

1　原理

抗原與抗體的結(jié)合能在瓊脂孔中產(chǎn)生沉淀線。

2　儀器設(shè)備

普通天平、吸管、三角瓶、90mm的平皿、冰箱、水浴箱、250ml量筒、打孔器、酒精燈、紗布、小刀、棉花、儀器、玻璃筆、帶蓋磁盤、恒溫箱、滴管。

3　試劑

優(yōu)質(zhì)瓊脂粉，蒸餾水，抗原，陽性血清，PBS液，

PBS液的配制：

pH7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。磷酸氫二鈉（12H2O）2.9g；磷酸二氫鉀0.3g；氯化鈉8.0g；無離子水式蒸餾水1000ml。

4　瓊脂板制備

瓊脂板規(guī)定為90mm平皿，外周孔徑為6mm、中央孔徑為4mm、空間距為3mm的打孔器，帶蓋瓷盤。將直徑90mm的平皿放在水平臺(tái)上，每平皿倒入熱瓊脂液15～18ml，厚度2.5mm左右。此環(huán)節(jié)很重要，操作者要在平日工作中多加練習(xí)，一定要均勻倒入，手要穩(wěn)、準(zhǔn)，不要產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)影響沉淀線的完整出現(xiàn)，影響結(jié)果判定。冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中4℃可保存2周左右。

5　打孔

反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打，這一點(diǎn)比較重要，不能因?yàn)闄z測的血樣數(shù)量多就提前批量打孔，否則影響封孔的效果，也會(huì)影響到結(jié)果判定。用外周孔徑為6mm、中央孔徑為4mm、孔間距為3mm的七孔打孔器在瓊脂板上打孔，打孔后用8＃針頭將孔內(nèi)瓊脂排出，用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛?cè)刍癁橹梗忾]孔的底部。這一步需要熟練操作的經(jīng)驗(yàn)，酒精燈的火候與溫度純屬個(gè)人經(jīng)驗(yàn)的積累，溫度低了封不住，加檢測試劑時(shí)會(huì)發(fā)生側(cè)漏，溫度過高時(shí)會(huì)烤化瓊脂，也會(huì)側(cè)漏，影響結(jié)果判定。

6　加樣檢測

在準(zhǔn)備好的瓊脂板上端寫上日期及編號(hào)。在中間孔加抗原，2、5孔加檢測用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其余1、3、4、6孔分別加入受檢馬血清，G為加抗原孔，（+）為加檢測用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔，加至孔滿為止，這一步需注意，加樣量要準(zhǔn)確，一般為30微升，但也要根據(jù)加樣孔的深淺調(diào)整樣品量，以孔剛好滿而不溢出為準(zhǔn)，平皿加蓋，待孔中液體吸干后，將平皿倒置，以防水分蒸發(fā)；瓊脂板則放入鋪有數(shù)層紗布的帶蓋搪瓷盤中。置15℃～30℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，逐日觀察3d并記錄結(jié)果，這一步需注意，一定要每日觀察并記錄清楚結(jié)果，為最后的判定做好準(zhǔn)備。

7　結(jié)果判定

為了判定觀察方便，在與平皿有適當(dāng)距離的下方，置一黑色紙或白紙襯托，有助于結(jié)果準(zhǔn)確判定。在觀察結(jié)果時(shí)，最好從不同折光角度仔細(xì)觀察平皿上抗原與受檢血清孔之間有無沉淀線。

7.1陽性

當(dāng)檢測用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原之間有一條明顯致密的沉淀線時(shí)，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線；或者陽性血清的沉淀線末端在毗鄰的被檢血清孔處向抗原孔側(cè)偏彎者，此種受檢血清判為陽性。對于陽性的血樣一定要再去采集一次血樣進(jìn)行檢測，如果第二次也是陽性才能最終判為陽性。如果第2次為陰性，必須重復(fù)采集第3次，3次中以2次相同的結(jié)果為最終結(jié)果。

7.2陰性

受檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線，或者標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原之間的沉淀線向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔側(cè)偏彎者，此種受檢血清為陰性。

7.3疑似

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間的沉淀線末端，似乎向毗鄰受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎，但不易判斷時(shí)，可將抗原稀釋2倍、4倍、6倍、8倍進(jìn)行復(fù)試。最后判定結(jié)果觀察時(shí)間可延至5d。這一點(diǎn)很重要，只要出現(xiàn)疑似結(jié)果的必須按上述方法進(jìn)行重復(fù)操作，直至能準(zhǔn)確判定為止，避免出現(xiàn)判定不準(zhǔn)確或者誤判的情況。

7.4注意事項(xiàng)

判定時(shí)要注意非特異性沉淀線。例如當(dāng)受檢馬匹近期注射過組織培養(yǎng)疫苗的乙型腦炎等，可見與檢查用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的沉淀末端不是融合而為交叉狀，兩個(gè)血清間產(chǎn)生的自身免疫沉淀線等。一定要充分掌握受檢馬匹的詳細(xì)免疫狀況與健康狀況后再進(jìn)行判定。

8　結(jié)語

馬傳染性貧血病瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)試驗(yàn)雖然看似簡單，但是作為一名實(shí)驗(yàn)人員，每一步過程必須認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)，熟練掌握試驗(yàn)過程的關(guān)鍵點(diǎn)，正確處理檢測過程中重要環(huán)節(jié)的細(xì)節(jié)，才能保證檢測結(jié)果的科學(xué)性與準(zhǔn)確性。

作者簡介：齊海霞（1973-），職稱：高級獸醫(yī)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)室管理及檢測。

通訊作者：張海云（1964-），職稱：高級獸醫(yī)師，研究方向：動(dòng)物疫病診斷。