楊軍霞 ， 雷程紅 ， 王振寶 ， 葛 婷 ， 卞賽賽 ， 王旭蕾 ， 徐 劍

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 新疆烏魯木齊830052；2．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 新疆烏魯木齊830052； 3．伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局， 新疆伊寧835000)

應(yīng)用LAMP技術(shù)鑒別豬牛羊肉

楊軍霞1， 雷程紅2， 王振寶3， 葛 婷2， 卞賽賽2， 王旭蕾1， 徐 劍1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 新疆烏魯木齊830052；2．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 新疆烏魯木齊830052； 3．伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局， 新疆伊寧835000)

肉類是否摻假是消費(fèi)者在購(gòu)買肉制品時(shí)比較注意的問(wèn)題，用豬肉、雞肉、鴨肉等價(jià)格便宜的肉摻入牛羊肉及其肉制品中，是牛羊肉制品最常見(jiàn)的摻假方式[1]。近年來(lái)，肉類摻假問(wèn)題已引起社會(huì)廣泛關(guān)注[2]。為了解牛羊肉制品中摻加豬肉情況，我們對(duì)霍爾果斯市幾家超市的牛羊肉及其肉制品進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣品 新鮮的牛肉、羊肉、豬肉、馬肉，火鍋用的羊肉卷，清真牛肉火腿腸，撒尿牛丸，牛肉丸子，雞肉火腿腸(成分中標(biāo)明有豬肉)。

1.2 引物 豬線粒體COXI基因LAMP引物參照楊麗霞等方法[3]，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 主要試劑 組織基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，BstDNA聚合酶(NEB)，SYBR Green-I核酸染料(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，PremixTaq酶、dNTPs、DL-2000 DNA Marker(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.4 主要儀器設(shè)備 LAMP實(shí)時(shí)濁度儀LA-320，電泳儀，紫外光度計(jì)，凝膠成像儀，恒溫溫勻器，冰箱，離心機(jī)，微量移液器。

1.5 樣品組織基因組的提取 按照組織基因組提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 豬線粒體COXI基因LAMP擴(kuò)增 LAMP反應(yīng)體系為25 μl：2*反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物1.0 μL，BstDNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)管渦旋混勻后置于LAMP實(shí)時(shí)濁度儀中，設(shè)置63 ℃ 60 min，80 ℃10 min擴(kuò)增。反應(yīng)體系中的模板分別為豬肉基因組DNA、牛肉基因組DNA、羊肉基因組DNA、馬肉基因組DNA、雙蒸水(空白對(duì)照)、待檢樣品基因組DNA。

2 結(jié)果

豬線粒體COXI基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果 63 ℃反應(yīng)30 min時(shí)，豬肉基因組DNA反應(yīng)管在濁度儀上的柱狀圖底部顯示為紅色，表示已經(jīng)擴(kuò)增出豬肉線粒體COXI基因。而牛、羊、馬肉基因組DAN反應(yīng)管和空白對(duì)照管對(duì)應(yīng)的柱狀圖底部為黃色，說(shuō)明沒(méi)有擴(kuò)增出豬肉線粒體COXI基因，見(jiàn)中插彩版圖1所示。肉眼觀察陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物，未見(jiàn)有明顯的顏色變化，但離心后可見(jiàn)有明顯的白色沉淀。擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green-I核酸染料1 μL，混勻后置于紫外儀中觀察，可見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物有熒光，陰性擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有熒光而是呈現(xiàn)染料本來(lái)的橘紅色，見(jiàn)中插彩版圖2所示。

用LAMP法共檢測(cè)9種肉及其肉制品，新鮮的豬肉、雞肉火腿腸(商品成分中標(biāo)明有豬肉)，豬線粒體COXI基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性；新鮮的牛肉、羊肉、馬肉，火鍋用的羊肉卷，清真牛肉火腿腸，撒尿牛丸，牛肉丸子中，豬線粒體COXI基因LAMP擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

3 討論

依靠感官檢驗(yàn)很難檢測(cè)出牛羊肉及其肉制品的摻加肉。近年來(lái)，食品中肉類成分的鑒別和分析已逐步采用蛋白檢測(cè)和核酸檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)對(duì)肉品種類的檢測(cè)可檢測(cè)到屬和亞屬級(jí)別，敏感度可達(dá)到納克級(jí)別[4]。本次調(diào)查中，采用了檢測(cè)核酸的LAMP技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感度高，反應(yīng)耗時(shí)短，技術(shù)和設(shè)備要求低[5-6]。該方法一旦建立，很適合在基層使用。在本試驗(yàn)我們用在LAMP濁度儀中篩選出的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間在恒溫溫勻器中進(jìn)行LAMP反應(yīng)，其結(jié)果與濁度儀的一致。但由于反應(yīng)后反應(yīng)管顏色變化不明顯，需離心沉淀或加入核酸染料后方可判定結(jié)果。開(kāi)蓋加入染料時(shí)有可能產(chǎn)生氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性出現(xiàn)，這點(diǎn)在試驗(yàn)時(shí)應(yīng)予注意。

本次調(diào)查的超市中的牛羊肉及其肉制品，未檢出其中摻加有豬肉。

[1] 李宗夢(mèng)，趙良娟，趙宏，等.肉及肉制品動(dòng)物源性成分鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2014，35(18)：122-126.

[2] 鐘賢武，林虹，談?dòng)罘?，?歐洲“馬肉事件”案例分析[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，39(6)：51-56.

[3] 楊麗霞，付淑君，彭新凱.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)牛羊肉中的豬肉成分[J].食品與機(jī)械，2013，29(5)：63-65.

[4] 何瑋玲，黃明，張馳.食品中肉類成分種屬鑒別技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2012，33(3)：304-307.

[5] 侯東軍，楊紅菊，于雷，等.環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法鑒定牛羊肉中的攙雜肉[J].食品工業(yè)科技，2012，33(22)：60-62.

[6] 李向麗，劉垚，譚貴良，等.基于LAMP法快速檢測(cè)羊肉及其制品中的豬、鴨和羊源性成分[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2015，27(3)：247-252.

2015-10-12

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目資助(2015KCX18)

楊軍霞(1992- )，女，本科生,就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè),E-mail:1209122156@qq.com

雷程紅，E-mail:leichxjnd@aliyun.com

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0529-6005(2016)12-0082-01