鈔　艷，趙凌艷，顏　梅，郭俐宏，吳勝英

骨瓜提取物對大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎HA、IL-1β、BMPs及MMP-1的影響

鈔艷1，趙凌艷1，顏梅1，郭俐宏1，吳勝英2*

[摘要]目的觀察骨瓜提取物注射液對大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、軟骨細胞MMP-1陽性表達及關(guān)節(jié)積液透明質(zhì)酸(HA)、白細胞介素-1β亞型(IL-1β)的影響，探討其作用機制。方法大鼠40只，隨機分為空白對照組、模型組、骨瓜小劑量組及骨瓜大劑量組，分別于模型組、骨瓜小劑量組、骨瓜大劑量組大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)多點注射小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑0.1 mL，制備類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動物模型，造模成功后，骨瓜小劑量組、骨瓜大劑量組分別用骨瓜提取物注射液肌注治療21 d，于治療第1、7、14、21天，分別測定四組大鼠關(guān)節(jié)積液中HA及IL-1β含量；檢測滑膜BMPs及MMP-1陽性表達，測量右足趾關(guān)節(jié)以下部位的容積并計算足腫脹度，記錄各組動物消腫時間，評價骨瓜提取物注射液對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果。結(jié)果治療下14、21 d時，骨瓜小劑量組、骨瓜大劑量組MMP-1陽性表達及關(guān)節(jié)積液中IL-1β明顯降低，BMPs及HA含量明顯升高，消腫時間縮短，足腫脹度明顯優(yōu)于模型組，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，骨瓜小劑量組、骨瓜大劑量組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論骨瓜提取物注射液可促進類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)積液HA及BMPs分泌與合成，降低軟骨細胞MMP-1陽性表達，抑制炎性介質(zhì)IL-1β對關(guān)節(jié)滑膜的侵蝕而起到保護關(guān)節(jié)的作用。

[關(guān)鍵詞]骨瓜提取物注射液；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞MMP-1；IL-1β；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；透明質(zhì)酸

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of bone melon extract injection on synovial bone morphogenetic protein (BMPs),effusion of cartilage cells MMP-1 positive expression and articular hyaluronic acid (HA),interleukin-1β (IL-1β)of rats with rheumatoid arthritis,and to explore its mechanism.MethodsForty rats were selected and randomized into control group,modern group,low-dose and high-dose bone melon extract group,the rheumatoid arthritis model was established by injection of bovine type Ⅱ collagen,the rats treated with bovine type Ⅱ collagen were in jected with bone melon low/high dose for 21 d.Interleukin-1β (IL-1β) in knee joint was measured by ELISA,hyaluronic acid (HA) content were measured by biochemistry,BMPs and MMP-1 in knee joint were measured.The volume of right knee art and below parts was measured and the percentage of swelling was calculated.Swelling time was recorded and animal treatment effect was evaluated at 1,7,14,21 d after operation.ResultsThe expression levels of IL-1β and MMP-1 decreased significantly,BMPs and HA content increased obviously of low-dose and high-dose bone melon extract group at 7,14,21 d after operation,swelling time was shortened,and the swelling degree was significantly better than that of model group (P<0.05).Low-dose and high-dose bone melon extract group had no significant difference.ConclusionBone melon extract can promote the secretion and synthesis of cartilage cells of HA and BMPs in joint effusion of rheumatoid arthritis rats,and reduce the positive expression of MMP-1,inhibit inflammatory mediators IL-1β on erosion immersed synovial joints and achieve the therapeutic effect.

收稿日期：2015-06-24

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512012

Effects of bone melon extract on HA,IL-1β,BMPs and MMP-1 of rats with rheumatoid arthritisCHAO Yan1,ZHAO Ling-yan1,YAN Mei1,GUO Li-hong1,WU Sheng-ying2*(1.Department of Endocrinology,Shiyan Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

Key words：Bone melon extract injection;Rheumatoid arthritis;Cartilage cell MMP-1;IL-1β;Bone morphogenetic protein;Hyaluronic acid

0引言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一類原因不明，好發(fā)于四肢關(guān)節(jié)、心臟等器官的自身免疫性疾病，臨床病理改變以四肢關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主，常累及關(guān)節(jié)軟骨滑膜及骨質(zhì)[1]。其病因主要為軟骨的破壞與變性，是軟骨分解與合成代謝失衡的結(jié)果[2]，此類疾病多發(fā)于中年以后的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，膝關(guān)節(jié)腔伴有大量積液為多見，臨床以四肢(膝關(guān)節(jié)為甚)疼痛、變形和活動受限為特點。臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進行性病程，并可致多個關(guān)節(jié)完全強直，骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)畸形，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的喪失，目前尚無理想的治療辦法。中醫(yī)認為，膝骨性關(guān)節(jié)炎屬“痹證”，“風(fēng)、寒、濕”合而成痹，此類患者常挾濕氣下注于關(guān)節(jié)[3]。由于軟骨分解及合成代謝失衡及筋絡(luò)脈隧痹阻不通，多繼發(fā)滑膜與滑液炎，其病理改變多以膝關(guān)節(jié)滑膜受損及關(guān)節(jié)腔積液為主[4]，本實驗采取骨瓜提取物注射液治療弗氏完全佐劑性大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，旨在挖掘祖國中醫(yī)藥治療關(guān)節(jié)炎的優(yōu)勢，探討其作用機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物Wistar大鼠40只，雌雄兼用，體重(250±50)g，實驗動物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2011-0008；實驗動物設(shè)施使用許可證：SYXK(鄂)2011-0031。二級潔凈動物房飼養(yǎng)，每籠1只，自由飲水，每日給予由動物中心配置的標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.2藥品與試劑骨瓜提取物注射液(哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H23023507)；小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑(上海實生細胞生物技術(shù)有限公司)。

1.3急性關(guān)節(jié)炎模型制備參照文獻[5]，碘伏浸泡大鼠右足趾消毒，模型組、骨瓜小劑量組及骨瓜大劑量組大鼠于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑0.1 mL，對照組注射等量生理鹽水，每日強迫動物活動30 min，14 d后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關(guān)節(jié)炎模型造模成功：①關(guān)節(jié)及其周圍僵硬、活動受限；②關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，同時軟組織腫脹或積液；③發(fā)病的部位常見于膝、髖、踝等關(guān)節(jié)處；④關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)白細胞介素-1β(IL-1β)降低、透明質(zhì)酸(HA)含量明顯升高；⑤關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜增生、粘連、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變，14 d后即得到穩(wěn)定的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。注射后創(chuàng)口碘伏浸泡消毒1周(1次/d)以預(yù)防感染。

1.4治療方法術(shù)后14 d造模成功后開始肌肉注射骨瓜提取物注射液治療，骨瓜小劑量組(1 mg)及骨瓜大劑量組(5 mg)均連續(xù)治療21 d。

1.5檢測指標(biāo)及方法參照文獻[6]，于治療后1、7、14、21 d分別抽取膝關(guān)節(jié)腔積液，采用酶標(biāo)雙抗體夾心ELISA法測定積液HA及IL-1β含量。參照文獻[7]檢測關(guān)節(jié)滑膜骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、軟骨細胞MMP-1陽性表達。足腫脹度的測定：四組動物均于實驗當(dāng)天測量右足趾關(guān)節(jié)以下部位的容積，連續(xù)3次，取平均值為右足容積，計算各組動物足腫脹度。前后容積之差值為腫脹程度，計算足腫脹百分率：足腫脹度(%)=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。記錄各組動物消腫時間。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS 17.0軟件，不同時點大鼠腦缺血再灌注EEG、rCBF比較采用重復(fù)測量方差分析，大鼠腦缺血梗死范圍采用兩兩比較t檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動物消腫時間及足腫脹度(%)比較骨瓜組在治療后7 d開始消腫，21 d后已接近正常，足腫脹度明顯低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，骨瓜小劑量組與骨瓜大劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1　各組動物足腫脹度比較(n=10)

2.2大鼠關(guān)節(jié)積液HA、IL-1β含量比較骨瓜組IL-1β含量在治療7 d開始明顯下降，21 d后已接近正常水平，HA明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，骨瓜小劑量組與骨瓜大劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3大鼠關(guān)節(jié)滑膜治療前后BMPs、軟骨細胞MMP-1陽性表達比較骨瓜組BMPs明顯升高，軟骨細胞MMP-1陽性表達下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。骨瓜小劑量組與骨瓜大劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1　大鼠關(guān)節(jié)積液IL-1β、HA含量比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2　大鼠關(guān)節(jié)滑膜BMPs、軟骨細胞MMP-1陽性表達比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3討論

骨瓜提取物注射液是用新鮮或冷凍的豬四肢骨和葫蘆科植物甜瓜Cucumis melo L的干燥成熟種子提取物制成的注射液[8]，富含多種游離氨基酸、甜瓜籽提取物、多肽類骨代謝因子(骨代謝的活性肽類)、無機鹽及微量元素等[9]，可調(diào)節(jié)骨代謝，刺激成骨細胞增殖，促進新骨形成以及調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，可增加骨鈣沉積而防治骨質(zhì)疏松，同時還具有鎮(zhèn)痛抗炎作用[10]。

機體在罹患類風(fēng)濕性疾病時，鈣、磷代謝失衡而造成骨質(zhì)疏松，四肢關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)滑膜均出現(xiàn)不同程度的炎性浸潤，關(guān)節(jié)積液中可出現(xiàn)不正常的IL-1β分泌增多，HA減少，關(guān)節(jié)滑膜MMP-1陽性表達升高及BMPs降低的現(xiàn)象，故本文測定4組大鼠關(guān)節(jié)積液中HA及IL-1β含量、滑膜BMPs及MMP-1陽性表達、右足趾關(guān)節(jié)以下部位的容積并計算足腫脹度，記錄各組動物消腫時間，評價骨瓜提取物注射液對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果。

實驗結(jié)果顯示，治療7、14、21 d時，治療組MMP-1陽性表達及關(guān)節(jié)積液中IL-1β明顯降低，BMPs及HA含量明顯升高，消腫時間縮短，足腫脹度明顯優(yōu)于模型組，表明骨瓜提取物注射液治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎能有效降低足腫脹度、IL-1β及MMP-1陽性表達，升高BMPs及HA，縮短消腫時間。其機制可能為機體在罹患類風(fēng)濕性疾病時，骨瓜提取物注射液通過抑制IL-1β產(chǎn)生，減輕關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的炎癥反應(yīng)，減輕軟骨細胞正常結(jié)構(gòu)和功能的破壞、基質(zhì)的降解，減少骨的吸收以及關(guān)節(jié)軟骨周圍骨贅的形成，從而減輕關(guān)節(jié)疼痛的臨床癥狀以及關(guān)節(jié)軟骨的破壞，改善關(guān)節(jié)功能。正常的關(guān)節(jié)滑液中僅含有微量的IL-1β，但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)液中IL-1β的含量則異常增高。IL-1β作為重要的炎性介質(zhì)具有細胞破壞能力，其在退行性骨關(guān)節(jié)病中發(fā)揮著重要作用。HA是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖單位有規(guī)律重復(fù)構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，化學(xué)本質(zhì)為糖胺多糖，廣泛分布于人及動物的結(jié)締組織、眼玻璃體、軟骨和滑液中，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成部分。HA可減少風(fēng)濕性關(guān)節(jié)內(nèi)炎性介質(zhì)的擴散，減少滑膜的通透性及關(guān)節(jié)內(nèi)滲液[11]。我們認為，滑液中HA含量升高是由于骨瓜提取物注射液促使滑膜內(nèi)襯B型滑膜細胞和單核吞噬細胞分泌HA，從而起到潤滑關(guān)節(jié)、保護關(guān)節(jié)軟骨、延緩軟骨退變的作用。這是一種“內(nèi)源性”HA，與外源性HA關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射比較，其作用時間更為長久。由于骨瓜提取物注射液中富含多種游離氨基酸，為成骨細胞合成BMPs、TGF-β等骨源性生物因子提供能量和原料，促進骨源性生物因子的合成。研究證實，骨瓜提取物注射液中的多肽類骨代謝因子可以增加BMPs的合成，抑制MMP-1的過度表達。本研究認為，其促進BMPs合成的主要藥理作用是促進成骨細胞有絲分裂及趨化作用[12]。BMPs作為一種骨誘導(dǎo)因子，是間充質(zhì)細胞向骨系細胞轉(zhuǎn)化的信號傳導(dǎo)介質(zhì)，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為成骨細胞和軟骨細胞的作用。同時，BMPs還可通過調(diào)節(jié)TGF-β和FGF而誘導(dǎo)新骨形成，從而促進鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積，防治和改善骨質(zhì)疏松的發(fā)生[13]。骨瓜提取物注射液中的甜瓜籽提取物能降低關(guān)節(jié)局部毛細血管通透性，減少IL-1β合成及炎性滲出，降低因炎癥刺激而造成MMP-1細胞陽性表達，促進局部炎癥及組織粘連時血運障礙的恢復(fù)，改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)。

綜上所述，骨瓜提取物注射液通過調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)積液中HA及IL-1β含量，滑膜BMPs及MMP-1陽性表達，影響關(guān)節(jié)及骨代謝，刺激成骨細胞增殖，調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，增加鈣沉積，防治骨質(zhì)疏松[14]，縮短消腫時間，具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

參考文獻：

[1]黃清春，陳紀(jì)藩，陳光星，等.通痹靈、雷公藤多甙及青藤堿對實驗性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織病理影響的比較研究[J].中國醫(yī)藥學(xué)報，2003，18(1)：12-14.

[2]國延軍,牟成林,程杰，等.祛瘀通痹湯治療原發(fā)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].河北中醫(yī)藥學(xué)報,2009，24(4)：2l-22.

[3]Amin AR,Dave M,Attur M,et al.COX-2,NO,and cartilage damage and repair[J].Curr Rheumatol Rep,2000,2(6):447-453.

[4]朱小龍，沈祥峰，常盛，等.薛氏方加味治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎48例臨床觀察[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2013，35(11)：1048-1049.

[5]熊國林，黃海瀟，謝玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32(2)：121-122.

[6]Wang Z,Qiu Y,Lu J,et al.Connective tissue growth factor promotes interleukin-1β-mediated synovial inflammation in knee osteoarthritis[J].Mol Med Rep,2013,8(3):877-882.

[7]孫必強，張鳴，李美珍，等.威靈仙注射液關(guān)節(jié)腔離子導(dǎo)入對骨關(guān)節(jié)炎軟骨和滑膜組織形態(tài)以及軟骨MMP-1的影響[J].中醫(yī)臨床研究,2014，6(17)：1-3.

[8]陳曉波，李麗.骨瓜提取物注射液促進骨折愈合的療效觀察[J].臨床醫(yī)藥,2011,20(3):73-75.

[9]孫立光，歐陽慧，郝釗，等.骨瓜提取物注射液應(yīng)用于四肢骨折術(shù)后患者的臨床價值[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,23(25):2776-2778.

[10]郭偉，李嫻，賀新寧，等.骨瓜提取物注射液治療膝骨性關(guān)節(jié)炎療效觀察[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2014，27(7)：848-849.

[11]唐瑭，陳德森，李莉，等.通痹外敷膏聯(lián)合關(guān)節(jié)腔沖洗治療膝骨性關(guān)節(jié)炎合并積液的臨床研究[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2011，3(11)：213-216.

[12]劉巍，梁志剛，張先鋒，等.轉(zhuǎn)化生長因子-B在骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中表達的實驗研究[J].中國藥物與臨床，2013，13(12)：1562-1564.

[13]王云，趙秉浩，張民，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7(4)：1684-1686.

[14]陳曉波，李麗.骨瓜提取物注射液促進骨折愈合的療效觀察[J].中國藥業(yè)，2011，20(3)：73-74.

作者單位：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，呼和浩特 010059