張 瑩，李章勝，毛碧增

（浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310058）

生防芽孢桿菌分泌的拮抗物質(zhì)的研究進(jìn)展

張 瑩，李章勝，毛碧增*

（浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，浙江杭州 310058）

芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）能分泌抗生素、抗菌蛋白、異構(gòu)香豆素類(lèi)等拮抗物質(zhì)，具有廣泛的抑制譜，是科研和生產(chǎn)中應(yīng)用較多的生防細(xì)菌。本文對(duì)近年來(lái)生防芽孢桿菌分泌的拮抗物質(zhì)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

芽孢桿菌；拮抗物質(zhì)；抗生素；抗菌蛋白；異構(gòu)香豆素類(lèi)

長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑會(huì)引起致病菌的耐藥性，造成環(huán)境污染，對(duì)人體健康造成潛在傷害，因此越來(lái)越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向生防微生物。因芽孢桿菌適應(yīng)逆境能力強(qiáng)，倍受科研工作者青睞，一度成為研究熱點(diǎn)。目前應(yīng)用于生物防治的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［1-2］、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）［3］、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）［4-5］、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）［6］、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）［7］及多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）［8］等。其中，枯草芽孢桿菌BSD-2能有效抑制黃瓜灰霉?。?］。焦延靜［10］報(bào)道，枯草芽孢桿菌能防治杜梨和葡萄根癌??；枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌也有一定的抑制作用［11］。2016年，陳成等［1］報(bào)道，枯草芽孢桿菌對(duì)桑椹鮮果采后的主要致腐菌核盤(pán)菌屬霉菌和鏈格孢屬霉菌均有抑制作用。解淀粉芽孢桿菌LX-11能通過(guò)分泌脂肽類(lèi)物質(zhì)和表面活性素防治水稻細(xì)菌性條斑?。?2］。從海南鹽堿土中分離的解淀粉芽孢桿菌LX1能通過(guò)分泌抗菌蛋白防治香蕉枯萎?。?3］；解淀粉芽孢桿菌菌株HN06對(duì)黑曲霉、稻瘟病菌均有良好的抑制作用［14］。多粘類(lèi)芽孢桿菌LM-3能通過(guò)分泌多肽類(lèi)物質(zhì)拮抗稻瘟?。?5］，多粘類(lèi)芽孢桿菌E681可抑制多種芝麻土傳病害，促進(jìn)芝麻的生長(zhǎng)；另外，多粘類(lèi)芽孢桿菌可有效防治蘋(píng)果樹(shù)腐爛?。?6］和花椒枯穗?。?7］。

近年來(lái)對(duì)芽孢桿菌生防機(jī)制的研究逐步深入。生防的機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)作用、誘導(dǎo)植物抗性、拮抗作用等，其生防效果往往是2種及以上機(jī)制的綜合結(jié)果。其中，拮抗作用是最主要的抗菌機(jī)制。生防菌能產(chǎn)生抗菌蛋白、抗生素類(lèi)及異構(gòu)香豆素類(lèi)等多種抗菌物質(zhì)。這些抗菌物質(zhì)會(huì)造成細(xì)胞畸變，從而抑制孢子萌發(fā)，或造成細(xì)胞壁的離解和消融，使原生質(zhì)發(fā)生凝集和外溢［18］。

自1945年Johnson等［19］報(bào)道枯草芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì)以來(lái)，經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的努力，人們已從芽孢桿菌的不同菌株中發(fā)現(xiàn)了一百多種拮抗物質(zhì)，主要包括抗生素、抗菌蛋白和異構(gòu)香豆素類(lèi)3類(lèi)。

1 抗生素類(lèi)

抗生素是芽孢桿菌通過(guò)拮抗作用分泌的一類(lèi)重要化合物。在枯草芽孢桿菌中，有大約4%～5%的基因組被利用合成抗生素，總長(zhǎng)度共計(jì)350 kb［20］。在抗生素中，研究較多的是肽類(lèi)抗生素，大多表現(xiàn)出較高的剛性和疏水性，具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)；包含特異組成，如右旋氨基酸，能抵抗肽酶和蛋白酶水解。另外，由于半胱氨酸殘基被氧化成二硫化物或被修飾成分子內(nèi)的硫醚鍵，因此肽類(lèi)抗生素具有抗氧化作用［21］。

抗生素合成途徑分為2種，一種是由核糖體合成前體，經(jīng)過(guò)翻譯后修飾形成有功能的抗生素，比如細(xì)菌素；另一種是通過(guò)非核糖體肽合成酶以非核糖體合成的形式進(jìn)行，包括脂肽類(lèi)抗生素，多肽類(lèi)抗生素和聚酮類(lèi)化合物等。另外Stein［20］發(fā)現(xiàn)，脂肽類(lèi)抗生素參與生物膜形成，細(xì)菌素在群體感應(yīng)中能夠作為信息素在同類(lèi)型的細(xì)胞中執(zhí)行程序性凋亡的功能。

1.1 細(xì)菌素

細(xì)菌素是通過(guò)核糖體途徑合成的、對(duì)微生物具有抗生作用的一類(lèi)小分子量蛋白質(zhì)。芽孢桿菌屬能產(chǎn)生多種細(xì)菌素［22-23］，包括未經(jīng)修飾的肽、含有二硫鍵的肽和含有羊毛硫的肽3類(lèi)，其中含有羊毛硫的肽被稱(chēng)為羊毛硫抗生素［24］。羊毛硫抗生素含有特殊的硫醚鍵，分子量小于5 ku，由19～38個(gè)氨基酸組成，含有大量的修飾氨基酸，如賴(lài)氨酸、脫氫丙氨酸、脫氫酪氨酸、羊毛硫氨酸亞砜等［25］。羊毛硫抗生素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，由于革蘭氏陰性菌的外膜能產(chǎn)生滲透性屏障，對(duì)革蘭陰性菌基本無(wú)抑制作用［26］。根據(jù)羊毛硫抗生素的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，可將其分為A、B 2大類(lèi)。A類(lèi)包含21～38個(gè)氨基酸，呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，帶正電荷，有兩親性；B類(lèi)呈球形，帶有負(fù)電荷，或者呈電中性，能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成［27］。

枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的Subtilin和Subtilosin分別屬于A類(lèi)和B類(lèi)，分子量分別為3 317和3 877 u。其中，Subtilin是研究較為清楚的細(xì)菌素，其前體是56個(gè)Aa小肽，其中24個(gè)Aa為信號(hào)肽，另外32個(gè)Aa是經(jīng)信號(hào)肽切除和一系列修飾包括Thr脫水和Ser與Cys硫酯化形成的活性小肽。在其合成過(guò)程中，基因簇編碼的LanP和LanT并不參與引導(dǎo)肽的切割，而是由3種細(xì)菌胞外的絲氨酸蛋白酶—subtilisin，WprA和Vpr來(lái)完成引導(dǎo)肽的切割［28］。Subtilosin A屬于B類(lèi)，具有大環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)包括李斯特菌屬在內(nèi)的多種革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用。另外表皮菌素、Ericin A和Ericin S也屬于A類(lèi)，其中Ericin A和Subtilin結(jié)構(gòu)相似，只是其中4個(gè)氨基酸殘基有差異。屬于B類(lèi)的還有Mersacidin，其基因簇包含了結(jié)構(gòu)基因m rsA，轉(zhuǎn)錄后修飾基因m rsM和m rsD等［20］。

除羊毛硫抗生素外還有很多其他的細(xì)菌素。由巨大芽孢桿菌產(chǎn)生的Megacins，分子量為1 825 u，對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制作用?？莶菅挎邨U菌則產(chǎn)生Botrycidin AJ1316、Alirin B-1和6.9 ku的未知小肽。

1.2 脂肽類(lèi)抗生素

脂肽類(lèi)抗生素主要分為表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、泛革素（Fengycin）3大類(lèi)。與蛋白相比，脂肽類(lèi)抗生素的分子量較小，其范圍介于200～3 000 u，平均分子量為1 000 u。Iturin的脂肪酸鏈長(zhǎng)度為C14～C17，surfactin為C13～C16，fengycin為C14～C18，因此每種脂肽類(lèi)抗生素都有多種同系物。

1.2.1 表面活性素（Surfactin）

Arima等［29］首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌分泌的晶狀表面活性劑，即surfactin，分子量約1 000 u，含有7個(gè)α-氨基酸，由13～15個(gè)碳原子的β-羥基脂肪酸交聯(lián)形成內(nèi)酯環(huán)狀極性分子。Surfactin是脂肪酸鏈參與成環(huán)的環(huán)狀脂肽，即脂肪酸的羧基與肽鏈氨基酸的N端相連，肽鏈氨基酸的C端羧基與脂肪酸的β-OH或β-NH2連接成環(huán)。表面活性素能抑制多種植物病原真菌和細(xì)菌，還具有殺蟲(chóng)作用，通過(guò)形成離子通道，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致內(nèi)容物的釋放，最終引起細(xì)胞的死亡［30］。

Surfactin家族主要包括枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的Surfactin、Esperins和地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的Surfactant86，Lichenysin A-D［31-32］。其中，Surfactin包括3種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其第7位氨基酸存在差異，分別為L(zhǎng)eu、Ile、Val。肽鏈中的氨基酸構(gòu)型保守，從N端到C端依次為L(zhǎng)-L-D-L-L-D-L，其中第3和第6位為D構(gòu)型氨基酸。由于肽鏈中氨基酸的數(shù)目、種類(lèi)及連接順序不同，形成多種脂肽同系物。呂應(yīng)年［33］曾報(bào)道發(fā)現(xiàn)的Surfactin類(lèi)似物已達(dá)到10多種。

1.2.2 伊枯草菌素（Iturin）

伊枯草菌素對(duì)大多數(shù)的致病酵母和霉菌有強(qiáng)烈的拮抗作用，對(duì)于植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)細(xì)菌的抑制作用相對(duì)微弱。家族成員包括Iturin（A，B，C，D，E），Bacillomycin（D，F(xiàn)，L，LC）和Mycosubtilin等［32，34-35］。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與表面活性素相似，都是脂肪酸鏈參與成環(huán)的環(huán)狀脂肽，肽鏈氨基酸構(gòu)型順序?yàn)長(zhǎng)-D-D-L-L-D-L，其中第2、3位為保守的D構(gòu)型的Tyr和Asn。

Bacillomycin的同系物具有相似的氨基酸順序和相同的β-氨基酸。Bacillomycin D的氨基酸順序?yàn)長(zhǎng)-Asn-D-Tyr-D-Asn-D-Pro-L-Glu-D-Ser-L-Thr，與其他iturin家族成員有同樣的Asx-Tyr-Asx，分子量為1 030（C14）和1 044 u（C15），對(duì)真菌有強(qiáng)烈抑制作用，對(duì)細(xì)菌的抑制作用較微弱［36-38］。1982年Michel等［39］從枯草芽孢桿菌I164中分離得到Bacillomycin F，氨基酸組成為D-Asp2，L-Asp1，LGlu1，L-Pro1，L-Thr1，D-Tyr1，與iturin A相似，只是將其中的絲氨酸殘基換成蘇酰胺殘基。1995年Mam iya等［40］從Bacillus subtilis FS94-14中分離得到Bacillomycin LC，結(jié)構(gòu)與Bacillomycin L相似，只是側(cè)鏈酰胺和羧基的位置有差異。

1.2.3 泛革素（Fengycin）

枯草芽孢桿菌F2923能產(chǎn)生抑制多種絲狀真菌生長(zhǎng)的脂肽類(lèi)抗生素，將其命名為Fengycin，主要包括Fengycin A、B和制磷脂素（plipastatin A1、A2、B1、B2），含有由氨基酸組成的環(huán)狀部分和長(zhǎng)鏈的脂肪酸支鏈，是脂肪酸鏈不參與成環(huán)的環(huán)狀脂肽，即脂肪酸通過(guò)自身的羧基與肽鏈氨基酸的N端形成酰胺鍵而連接在肽鏈結(jié)構(gòu)上。該類(lèi)物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗真菌活性，尤其是對(duì)絲狀真菌［41］。其合成基因?yàn)閒enA，fenB，fenC，fenD，fenE。Plipastatin與Fengcin極為相似，只是Tyr的構(gòu)型不同［42］。另外，Das等［43-44］發(fā)現(xiàn)，蘇云金芽孢桿菌CMB26能產(chǎn)生類(lèi)似于Fengycin的脂肽類(lèi)抗生素。

1.2.4 其他脂肽類(lèi)抗生素

除此3大類(lèi)，還有一些其他的脂肽類(lèi)抗生素。2000年，從蘇云金芽孢桿菌HD-1菌株中分離出6種Kustakins，其分子量為907.476 5～953.519 2 u，其結(jié)構(gòu)為脂肪酸-Thr-Gly-Ala-Ser-His-Gln-Gln，C端氨基酸與Ser羥基形成四肽內(nèi)脂環(huán)［45］。隨后，該物質(zhì)在蠟樣芽孢桿菌中也被分離得到。2002年，從Bacillus subtilis FR-2中分離得到3種bacillopeptins［46］，分子量分別為1 019.505 4、1 033.514 6和1 047.514 6 u，它們是由長(zhǎng)鏈β-氨基酸組成的環(huán)脂肽。另外還有桿菌溶素（Bacilysin），其分子量為270 u，合成基因簇為yw fB，C，D，E，F(xiàn)，G，H［20］。地衣菌素（Licheniformin）的分子量4 500 u，多數(shù)呈閉合環(huán)狀。

1.3 多肽類(lèi)抗生素

多肽類(lèi)抗生素分為分支環(huán)狀、線狀、環(huán)狀和線環(huán)狀等多種。分支環(huán)狀多肽抗生素主要作用于細(xì)菌，包括polymyxin，Octapeptins和Bactracin［22］。其中polymyxin是酰基十肽，結(jié)構(gòu)為脂肪酸-Dbu-Thr-Dbu（D-Ser）-Dbu-Dbu-D-Leu（D-Phe）-Leu（Thr or Ile）-Dbu-Dbu-Leu（Dbu是2，4-二氨基丁酸）。Bactracin分離自地衣芽孢桿菌，是十二肽抗生素，其中7個(gè)氨基酸成環(huán)，5個(gè)氨基酸呈線性。Octapeptins為八肽，與polymyxin相比，主要是線性的部分缺少Dbu-Thr殘基。

線狀多肽抗生素主要包括由Bacillus brevis產(chǎn)生的Edeine和Gramicidin［32］，對(duì)真菌有強(qiáng)烈的拮抗作用。Gram icidin的結(jié)構(gòu)為甲酰-Val-Gly-Ala-D-Val-Val-D-Val-Trp-（D-Leu-Trp）3-Etn（乙醇胺），Edeine的結(jié)構(gòu)為β-Tyr-Ise-D-Pro-Dha-Gly-Dpermidine。

環(huán)狀抗生素包括由Bacillus.brevis產(chǎn)生的Gram icidin S和Tyrocidine［32］，從海洋菌株中分離得到的5種環(huán)二肽（環(huán)Leu-Ile，環(huán)Val-Leu，環(huán)Ala-Val，環(huán)Ala-Ile和環(huán)Ala-Leu）［47］，從多粘類(lèi)芽孢桿菌中分離得到的10種Fusaricidins。其中，Gram icidin S是由完全一樣的2個(gè)五肽首尾相連組成的環(huán)狀短肽抗生素，由L-Ala和稀有氨基酸L-anticapsin組成，是最簡(jiǎn)單的多肽抗生素。Tyrocidine是環(huán)狀十肽，其中5個(gè)氨基酸序列與Gram icidin S完全一樣，另外5個(gè)氨基酸序列為-Phe-D-Phe-Asn-Gln-Tyr。10種Fusaricidins包括LIF03、LI-F04、LI-F05、LI-F06、LI-F07、LI-F08和從多粘類(lèi)芽孢桿菌KT-8中分離到的Fusaricidins AD（883.5、897.5、947.5和961.5 u）［46］，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)烈的殺菌活性，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有強(qiáng)烈的拮抗作用。另外，多粘類(lèi)芽孢桿菌能產(chǎn)生一類(lèi)線環(huán)狀陽(yáng)離子多肽抗生素，稱(chēng)為多粘菌素（polymyxins），含有疏脂性和親脂性基團(tuán)及1個(gè)多肽尾，包括polymyxins A，B，C，D和E，分子量都在1 200 u左右，對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陰性菌有殺菌作用。

另外還有一些多肽類(lèi)的抗生素，如Gavaserin，分子量為911 u，由谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、2，4-二氨基丁酸以及辛酸組成。Saltavalin分子量為903 u，含有絲氨酸、丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、2，4-二氨基丁酸。劉穎等［48］從枯草芽孢桿菌中分離得到的廣譜抗真菌肽LP-1，分子量為1 057.3 u。蠟樣芽孢桿菌分泌的廣譜抗真菌物質(zhì)Azoxybacillin［19，49］，由1個(gè)脂肪氨基酸和甲基偶氮氧側(cè)鏈組成，能抑制真菌對(duì)硫的吸收［50］。枯草芽孢桿菌A30和內(nèi)生枯草芽孢桿菌BS-2菌株也分泌抗菌多肽。

1.4 聚酮類(lèi)化合物

聚酮化合物是由低級(jí)脂肪酸聚合而成的，具有長(zhǎng)碳鏈結(jié)構(gòu)的一類(lèi)天然物質(zhì)，主要包括Dfficidin，Macrolactin和Bacillaene 3類(lèi)，對(duì)細(xì)菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。在商品化的菌株解淀粉芽孢桿菌FZB42中，操縱子pks1，pks2，pks3控制聚酮類(lèi)化合物的合成，其中pks1控制Bacillaene的合成，pks2控制Macrolactin的合成，pks3控制Dfficidin的合成［51］。目前，對(duì)于聚酮類(lèi)化合物的生物合成途徑研究得比較多，但其抑制細(xì)菌的作用機(jī)理尚不明確。

自1989年Gustafson等［52］從未知的深海細(xì)菌中提取了8種次生代謝產(chǎn)物Macrolactins（分別為Macrolactin A—F，macrolactinic acids和isomacrolactinic acids）之后，聚酮類(lèi)化合物逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。Macrolactin由二十四環(huán)內(nèi)酯、葡萄糖β-吡喃糖苷和碳酸鏈組成。其中，Macrolactin A（402.231 0 u）能抑制黑色素瘤和哺乳動(dòng)物的皰疹病毒，還能保護(hù)T淋巴細(xì)胞，避免HIV病毒的繁殖。2000年，Jaruchoktaweechai等［53］從芽孢桿菌屬Sc026中分離得到macrolactin F，7-O-succinyl macrolactin F和7-O-succinyl macrolactin A，其中macrolactin F是macrolactin A的同分異構(gòu)體，7-O-succinyl macrolactin F和7-O-succinylmacrolactin A的分子量均為502.246 4 u。2008年Xue等［54］又從海洋芽孢桿菌中分離得到macrolactins A，B，D，O，S，T，U，其中macrolactins T，U的分子量分別為419.242 8和481.331 5 u，能夠拮抗稻梨孢、金黃色葡萄球菌和鏈格孢屬等多種真菌。2008年，Lu等［55］從海洋芽孢桿菌屬中發(fā)現(xiàn)了macrolactin S，A和B，它們對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抗性。其中macrolactin S的C-12被羥基化，分子量為418.245 4 u。迄今已發(fā)現(xiàn)20多種macrolactins，其中7種分子量均為402 u［51］。

Bacillaene是線性結(jié)構(gòu)的六烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，從解淀粉芽孢桿菌FZB 42中分離得到Bacillaene A和Bacillaene B，分子量分別為580.5和582.5 u［56］。

Dfficidin是多烯類(lèi)抗生素，是具有罕見(jiàn)的磷酸基團(tuán)的高度不飽和的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)。從解淀粉芽孢桿菌FZB 42中分離得到Dfficidin和oxydifficidin，分子量分別為544.4和560.3 u。

除這3大類(lèi)外，2014年Ranga等［57］從解淀粉芽孢桿菌AP183中分離得到Bacillus in A，分子量為1 196.617 2 u，能拮抗耐青霉素的葡萄球菌（MRSA）。

2 抗菌蛋白

大多數(shù)生防芽孢桿菌能產(chǎn)生拮抗蛋白，包括細(xì)菌素、細(xì)胞壁降解酶類(lèi)（幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、β-1，3葡聚糖酶）及一些未知的蛋白。王雅平等［58］發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌A104在抑制小麥赤霉菌過(guò)程中產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)大多是拮抗蛋白；陳艷芬等［59］也證明了枯草芽孢桿菌BSY-2中發(fā)揮拮抗作用的主要活性物質(zhì)為抗菌蛋白；鄧陽(yáng)［60］從多粘類(lèi)芽孢桿菌Jsa-9中分離得到富含11種氨基酸的蛋白，分子量為71.9 ku，對(duì)霉菌有抑制作用。

2.1 幾丁質(zhì)酶

大部分生防芽孢桿菌可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶或β-1，3-葡聚糖酶，或者同時(shí)產(chǎn)生2種酶，通過(guò)協(xié)同作用溶解病原真菌的菌絲，并通過(guò)信號(hào)分子來(lái)誘發(fā)寄主植物的防御反應(yīng)。

幾丁質(zhì)酶是一種分解聚N-乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶，通過(guò)降解真菌細(xì)胞壁達(dá)到拮抗效果。Mavingui等［61］從多粘類(lèi)芽孢桿菌中分離得到具有抗菌活性的幾丁質(zhì)酶。從百合根際分離得到的拮抗細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌28-9可產(chǎn)生至少2種幾丁質(zhì)酶（Chi CW、Chi CH）。其中，Chi CH對(duì)百合葉枯病致病菌的孢子萌發(fā)有抑制效果［62］。2010年肖亮等［63］報(bào)道，地衣芽孢桿菌MY75菌株分泌的55 ku蛋白與67 ku蛋白能抑制小麥赤霉及黑曲霉的孢子萌發(fā)，并對(duì)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)活力具有增效作用。迄今已報(bào)道的具有幾丁質(zhì)酶活性的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌［64］、地衣芽孢桿菌［63］、蘇云金芽孢桿菌［65］、蠟樣芽孢桿菌［62］和環(huán)狀芽孢桿菌［66］等。

2.2 β-1，3葡聚糖酶

β-1，3葡聚糖酶是植物病程相關(guān)蛋白，與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用抑制真菌生長(zhǎng)。β-1，3葡聚糖酶能水解β（1→3）糖苷鍵，從而拮抗真菌。芽孢桿菌能產(chǎn)生多種葡聚糖酶，包括β-1，3-葡聚糖、β-1，4-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶和endo-（l，3-1，4）-β葡聚糖酶等，其中β-1，3-葡聚糖酶有分解真菌細(xì)胞壁的作用。多種芽孢桿菌能同時(shí)產(chǎn)生1種或多種幾丁質(zhì)酶［64］。朱茂山等［67］從枯草芽孢桿菌B18菌株中分離到幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶；姚烏蘭等［68］從多粘類(lèi)芽孢桿菌WY110中分離純化得到蛋白質(zhì)P2，分子量為26 ku。Blast P表明，P2蛋白與1株已報(bào)道的多粘類(lèi)芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因gluB的同源性為84%，基本可以確定為β-1，3葡聚糖酶；金志雄等［69］從藥用植物黃姜中分離的內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株SWB8能分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，有廣譜的抗菌活性和抗腫瘤活性。

抗菌蛋白除了幾丁質(zhì)酶和β-1，3葡聚糖酶2大類(lèi)，還有許多蛋白目前沒(méi)有被明確歸類(lèi)。TasA對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和陰性細(xì)菌均具有廣譜抗菌活性［70］。TasA伴隨著芽孢的形成在芽孢內(nèi)產(chǎn)生，大約0.5 h后，向芽孢外分泌［71］。Liu等［72］從枯草芽孢桿菌B-916中分離到1種新的蛋白質(zhì)Bacisubin，分子量為41.900 u；Hathout等［45］從枯草芽孢桿菌B29菌株中分離到抗菌蛋白B29I，分子量約為42.3 ku；劉俏等［73］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Q-12能產(chǎn)生抗菌蛋白QA-2；陳雪麗等［74］從多粘類(lèi)芽孢桿菌BRF-1中分離到抗菌蛋白，分子量為35.4 ku，對(duì)大豆立枯絲核菌具有拮抗活性；紀(jì)兆林等［75］從地衣芽孢桿菌W10中分離得到的抗真菌蛋白，分子量為46 049.2 u；劉穎等［48］從絲瓜根部分離到1株強(qiáng)烈抑制玉蜀黍赤霉病菌的拮抗菌枯草芽孢桿菌TG26，并從中分離到2種抗真菌蛋白BⅠ和BⅡ，對(duì)玉蜀黍赤霉病菌的多個(gè)生理小種表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制作用，對(duì)水稻稻梨孢、長(zhǎng)柄鏈格孢、玉米小斑病菌及綠色木霉也有強(qiáng)烈的拮抗作用。

另外，除了沒(méi)有明確分類(lèi)的抗菌蛋白，近年來(lái)我國(guó)有很多分離純化芽孢桿菌未知抗菌蛋白的報(bào)道。如枯草芽孢桿菌R21-4分泌的分子量在6.4～7.2 ku的抗菌蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌均有一定的拮抗作用［76］。水稻內(nèi)生枯草芽孢桿菌G87能分泌具有抗菌作用的不含芳烴的糖蛋白，分子量為50.8 ku［77］。2012年張淑梅等［78］發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌TF26能分泌抗菌蛋白，對(duì)葵花菌核病菌、番茄和黃瓜枯萎病菌、黃瓜菌核病菌和立枯病菌、水稻惡苗病菌和大豆根腐病菌等的抑制作用較強(qiáng)。

3 異構(gòu)香豆素類(lèi)

2011年，Hamdache等［79］從芽孢桿菌屬中分離出6種異構(gòu)香豆素類(lèi)的代謝物，發(fā)現(xiàn)其有多種生物活性，包括細(xì)胞毒性、抗菌性、抗?jié)兒湍芤种浦参锷L(zhǎng)等。這6種物質(zhì)后來(lái)被鑒定為bacilosarcin B、amicoumacin A-C和AI-77-F。其中bacilosarcin B和am icoumacin A對(duì)海拉細(xì)胞有細(xì)胞毒性，對(duì)金黃色葡萄球菌等多種菌有拮抗作用。Azumi等［80］從枯草芽孢桿菌TP-B0611中分離得到bacilosarcin A和B，分子量分別為491.226 7和494.249 69 u，其中bacilosarcin A能抗瘧原蟲(chóng)［81］。2012年Li等［82］從枯草芽孢桿菌B1779中分離得到lipoamicoumacin A-D和bacilosarcin C，其分子量依次為703.392 1、717.406 2、717.406 2、731.421 5和495.234 4 u。這5種物質(zhì)對(duì)海拉細(xì)胞均有細(xì)胞毒性，對(duì)葡萄球菌、芽孢桿菌、銅綠假單胞菌，青紫色素桿菌等有拮抗作用，并且C-12酰胺基可能是拮抗作用的功能基團(tuán)。

4 其他抗菌物質(zhì)

除上述3大類(lèi)抗菌物質(zhì)，芽孢桿菌還可產(chǎn)生其他抗菌物質(zhì)?？莶菅挎邨U菌B9987能產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)［83］，對(duì)茄交鏈孢菌、大麗輪枝菌、黃枝孢菌、立枯絲核菌的抑制作用較強(qiáng)，表現(xiàn)為真菌孢子或菌絲末端膨大成球狀，繼而胞壁崩解，原生質(zhì)外泄。酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌和萵苣霜霉菌也有抑制作用，表現(xiàn)為孢子萌發(fā)率降低和芽管長(zhǎng)度明顯變短。另外，蠟狀芽孢桿菌UW85分泌抗菌物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-氨基-3-脫氧-D-葡萄糖的氨基糖苷。

5 問(wèn)題與展望

近年來(lái)，從芽孢桿菌當(dāng)中提取的拮抗化合物不斷增多。對(duì)于前人研究當(dāng)中一些未知的物質(zhì)，借助現(xiàn)代的技術(shù)也確定了其分類(lèi)，并闡明了其結(jié)構(gòu)。就細(xì)菌素而言，目前對(duì)其研究已深入到分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制等方面。脂肽類(lèi)、多肽類(lèi)抗生素的研究也較為深入，許多物質(zhì)的合成基因也被報(bào)道。但由于某菌株往往產(chǎn)生一系列結(jié)構(gòu)和功能緊密相關(guān)的肽類(lèi)物質(zhì)，很少產(chǎn)生單一成分的抗菌物質(zhì)，并且肽類(lèi)物質(zhì)一般相差一個(gè)氨基酸，最多相差幾個(gè)氨基酸，因此脂肽類(lèi)、多肽類(lèi)抗生素的分離純化仍是一個(gè)難題。對(duì)于聚酮類(lèi)化合物的生物合成途徑研究得較多，但其抑制細(xì)菌的作用機(jī)理尚不明確。另外，許多研究發(fā)現(xiàn)的未知抗菌蛋白還有待分類(lèi)。

基于芽孢桿菌良好的拮抗作用，部分菌株已進(jìn)行商品化生產(chǎn)，如GB03、MB1600、QST713和FZB24等枯草芽孢桿菌株系已在美國(guó)被開(kāi)發(fā)利用［84-85］；無(wú)公害、無(wú)污染農(nóng)藥百抗（有效成分是枯草芽孢桿菌B908）已在中國(guó)農(nóng)藥部登記注冊(cè)，在大田應(yīng)用中對(duì)水稻紋枯病的防效達(dá)70%以上［84］。我國(guó)研制的麥豐寧（有效成分是枯草芽孢桿菌B3）對(duì)小麥紋枯病的田間防效達(dá)50%～80%［85］。越來(lái)越多的生物防治手段可以減少化學(xué)殺菌劑的使用，減少其在環(huán)境中的殘留，從而造福生態(tài)環(huán)境，為全人類(lèi)帶來(lái)福音。

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S432

：A

：0528-9017（2016）12-1960-08

文獻(xiàn)著錄格式：張瑩，李章勝，毛碧增.生防芽孢桿菌分泌的拮抗物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：1960-1967.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161206

2016-07-19

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2012C12912-7）；浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作計(jì)劃項(xiàng)目（ZJ-SN-201409）；浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院第十八期SRTP項(xiàng)目

張 瑩（1995—），女，浙江杭州人，本科生，研究方向組織培養(yǎng)及抗病分子育種，E-mail：zhangy95@outlook.com。

毛碧增，博士，研究員，從事植物基因工程育種與抗病信號(hào)傳導(dǎo)等研究工作，E-mail：maobz@zju.edu.cn。