張學(xué)文，楊 爽，2*，宋文菲，苗春輝，陳順安，黃新球，羅衛(wèi)庭

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

春繁期補(bǔ)飼花粉和橡膠蜂蜜對(duì)中蜂囊狀幼蟲病的防控探究

張學(xué)文1，楊 爽1，2*，宋文菲1，苗春輝1，陳順安1，黃新球1，羅衛(wèi)庭1

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

中蜂囊狀幼蟲?。ê?jiǎn)稱中囊?。┦俏：χ腥A蜜蜂養(yǎng)殖最為嚴(yán)重的病毒病，中蜂一旦感染中蜂囊狀幼蟲病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV），很難治愈。為研究營(yíng)養(yǎng)飼喂對(duì)中囊病的防治效果，在春繁期定期對(duì)已檢測(cè)患中囊病的蜂群補(bǔ)充飼喂花粉和橡膠蜂蜜，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲感染CSBV情況。結(jié)果顯示，補(bǔ)飼花粉和橡膠蜂蜜后，感染CSBV蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，但蜂群“爛子”明顯減輕，患病蜂群由顯性感染轉(zhuǎn)為隱性感染。表明春繁期補(bǔ)充飼喂花粉和橡膠蜂蜜對(duì)中囊病有一定的防控效果，能提高蜂群的抗病力，但不能根除CSBV。

中華蜜蜂；囊狀幼蟲??；春繁期；花粉；橡膠蜂蜜；補(bǔ)充飼喂

蜜蜂囊狀幼蟲?。╯acbrood disease）簡(jiǎn)稱囊幼病，又叫尖頭病、囊雛病，是由囊狀幼蟲病毒（sacbrood virus，SBV）感染引起的一種對(duì)蜜蜂幼蟲危害巨大的傳染?。?］，感染SBV的蜜蜂幼蟲皮下積累大量蛻皮液不能化蛹［2］，極大地影響蜂群的群勢(shì)和生產(chǎn)能力。感染中華蜜蜂的囊幼病被稱為中蜂囊狀幼蟲?。ê?jiǎn)稱中囊?。?，病原為中蜂囊狀幼蟲病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）［3］。蜂群一旦患上中囊病，很難治愈。目前，對(duì)于中囊病主要采取預(yù)防為主的策略，包括降低巢內(nèi)濕度、補(bǔ)充蜂群營(yíng)養(yǎng)、提高蜂群抵抗力等［4］。

中囊病的發(fā)生與外界氣候、蜜源、蜂種等有密切的關(guān)系，具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在春繁和秋繁季節(jié)［5］，發(fā)病初期，患病死蟲被工蜂消除或封蓋后的幼蟲被工蜂咬破，蜂王重新產(chǎn)卵，封蓋子脾出現(xiàn)嚴(yán)重的“花子現(xiàn)象”，即“花子脾”和“穿孔子脾”。CSBV主要危害蜜蜂幼蟲，也能侵染蜂蛹和幼年成蜂，CSBV在成蜂體內(nèi)繁殖，特別是在工蜂的咽下腺和雄蜂的腦內(nèi)積累，感染CSBV的工蜂并不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀［6］，但CSBV在其體內(nèi)潛伏時(shí)間很長(zhǎng)，會(huì)縮短成蜂壽命，并引起其生理和行為的改變［7-8］。

春繁期蜂群開始擴(kuò)巢育子，蜂群子脾大，群內(nèi)幼蟲多，一旦蜂群缺蜜或花粉，幼蟲就會(huì)營(yíng)養(yǎng)不良，使得抵抗力也下降，為CSBV的繁殖提供了良好的條件［9］。營(yíng)養(yǎng)充足是蜂群健康和增強(qiáng)抗病力的重要基礎(chǔ)，胡宗文等［10-11］報(bào)道春繁期補(bǔ)充飼喂花粉對(duì)中蜂群勢(shì)有促進(jìn)作用，蜂群封蓋子數(shù)量隨飼喂花粉時(shí)間的推移逐漸增加；同時(shí)，補(bǔ)充飼喂花粉的幼蜂在形態(tài)學(xué)特征上更接近于正常發(fā)育的成年蜂，補(bǔ)飼花粉能促進(jìn)工蜂的健康發(fā)育。CSBV的季節(jié)性變化，從某種程度上反映出蜂群對(duì)于病毒具有不同的抵抗力［4］。鑒于此，為研究營(yíng)養(yǎng)飼喂對(duì)中囊病的防治效果，在春繁期定期對(duì)已檢測(cè)患中囊病的蜂群飼喂花粉和橡膠蜂蜜，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲染CSBV情況，以期為中囊病的傳播機(jī)理和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)蜂群（3群）由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所提供，2015年10月檢測(cè)實(shí)驗(yàn)蜂群內(nèi)成年工蜂和雄蜂精液均攜帶CSBV；蜂蜜為橡膠蜂蜜，花粉為雜花粉和代用花粉，均由云南省普洱蜜海養(yǎng)蜂農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社提供。

總RNA提取試劑Trizol、TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）購(gòu)自TaKaRa公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 蜂群飼喂和樣本采集

花粉飼喂。雜花粉、代用粉、白糖按1∶1∶1比例，用水調(diào)成團(tuán)，蒸15 min成餅，放框梁，間隔5 d飼喂1次，飼喂時(shí)間2015年12月26日至2016年3月10日。

糖水飼喂。白糖和水按1∶1比例，每群200mL，于2015年12月30-31日飼喂2次。

蜂蜜飼喂。按每群0.3 kg橡膠蜂蜜，持續(xù)不間斷飼喂蜂群，飼喂時(shí)間2016年1月20日至2月21日。

飼喂后樣品采集時(shí)間為2016年3月29日，每群采集成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲各10只，-80℃保存。

1.3 總RNA提取

將樣品分裝于1.5 m L離心管內(nèi)，各加入1 m L Trizol，用玻璃研棒充分勻漿，靜置5 min，加入200μL氯仿，震蕩，靜置2 min，4℃12 000 r· min-1離心15 min；取上清液300μL，加等量的異丙醇，混勻，靜置10 min，4℃10 000 r·min-1離心10 min；沉淀以75%DEPC酒精洗，4℃10 000 r· min-1離心5 min；倒去酒精，真空抽干，用40μL RNase Free dH2O溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)和RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中SBV全序列保守區(qū)段設(shè)計(jì)擴(kuò)增CSBV片段基因引物，上游引物：5’-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3’，下游引物：5’-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3’。RT-PCR擴(kuò)增體系（20μL）：RNase Free dH2O 8.7μL，MgCl2（25 mmol·L-1）4.0μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2.0μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）2.0μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.3μL，AMV Reverse Transcriptase XL（5 U·μL-1）0.3μL，AMV-Optimized Taq polymerase（5 U·μL-1）0.3μL，上、下游引物各0.8μL，RNA 0.8μL。反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 m in，共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂前采樣觀察和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

飼喂前，采樣觀察群1、群2、群3蜂群封蓋子脾“爛子”嚴(yán)重；RT-PCR檢測(cè)群1、群2、群3雄蜂精液和成年工蜂各5個(gè)樣本，結(jié)果（圖1—2）顯示，雄蜂精液染病率分別為100%、100%和40%，成年工蜂3群染病率均為100%，蜂群表現(xiàn)為顯性感染。

圖1 雄蜂精液CSBV檢測(cè)結(jié)果

圖2 雄蜂精液和成年工蜂CSBV檢測(cè)結(jié)果

2.2 飼喂后采樣觀察和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

飼喂后，采樣觀察群1封蓋子脾“爛子”嚴(yán)重，群2、群3無“爛子”現(xiàn)象，觀察不出患病情況；RT-PCR檢測(cè)群1、群2、群3成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲各4個(gè)樣本，結(jié)果（圖3—5）顯示，成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，群1表現(xiàn)為顯性感染，群2、群3表現(xiàn)為隱性感染。

圖3 群1成年工蜂和工蜂幼蟲CSBV檢測(cè)結(jié)果

圖4 群2成年工蜂和雄蜂幼蟲CSBV檢測(cè)結(jié)果

圖5 成年工蜂、雄蜂和工蜂幼蟲CSBV檢測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

春繁期間，蜂群群勢(shì)增長(zhǎng)激烈，蛋白質(zhì)的攝入量對(duì)蜂群增長(zhǎng)起決定性作用。蜂群營(yíng)養(yǎng)不良是發(fā)生疾病的重要誘因，保證蜂群充足而全面的營(yíng)養(yǎng)是預(yù)防和治療蜂病的重要措施［12］。試驗(yàn)中對(duì)檢測(cè)患有中囊病的蜂群定期補(bǔ)飼花粉、糖水和橡膠蜂蜜，發(fā)現(xiàn)蜂群中“花子脾”和“穿孔子脾”明顯減少，其中群2、群3補(bǔ)充飼喂前幼蟲爛子嚴(yán)重，飼喂后已觀察不出患病癥狀，說明春繁期補(bǔ)充飼喂對(duì)中囊病有一定的防治效果，這與劉俊峰等［13］研究報(bào)道相符，即春繁期蜂群內(nèi)蜂花粉短缺，營(yíng)養(yǎng)供不上，會(huì)出現(xiàn)幼蟲被拖等情況。春繁期蜂群中充足的蛋白質(zhì)供給不僅能保障蜜蜂健康發(fā)育，而且強(qiáng)壯的體格在防御外敵入侵和獲得充足的食物中有明顯優(yōu)勢(shì)，也為蜜蜂在復(fù)雜多變的環(huán)境中生存繁殖提供了基礎(chǔ)。

通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充飼喂后蜂群中成年工蜂、工蜂幼蟲和雄蜂幼蟲均攜帶CSBV，染病率分別為91.7%、50.0%和100.0%，與飼喂前雄蜂精液CSBV感染率80%和成年工蜂CSBV感染率100%一致，表明春繁期補(bǔ)充飼喂花粉和橡膠蜂蜜不能根除CSBV。試驗(yàn)中患病蜂群在補(bǔ)充飼喂花粉和橡膠蜂蜜后無明顯發(fā)病癥狀，可能是補(bǔ)充飼喂后，蜂群內(nèi)蜜粉源充足，蜂群群勢(shì)恢復(fù)，繁育新蜂，增強(qiáng)了蜂群對(duì)病害的抵抗能力，患病蜂群由顯性感染轉(zhuǎn)為隱性感染，這與宋文菲等研究報(bào)道的蜂群中CSBV隱形感染大于顯性感染一致［14-15］。CSBV隱性感染雖不出現(xiàn)臨床癥狀，但病毒仍在寄主體內(nèi)增殖并通過寄主散播傳染。春繁季節(jié)，外界氣候多變，蜂群易出現(xiàn)蜜粉源供應(yīng)不足，此時(shí)潛伏在蜜蜂體內(nèi)的病毒可能受蜂群內(nèi)外環(huán)境的變化而突發(fā)癥狀。因此，在春繁期，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充飼喂額外的花粉和蜂蜜，以滿足蜂群的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而控制中囊病的爆發(fā)。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S895.1

：A

：0528-9017（2016）12-2114-03

文獻(xiàn)著錄格式：張學(xué)文，楊爽，宋文菲，等.春繁期補(bǔ)飼花粉和橡膠蜂蜜對(duì)中蜂囊狀幼蟲病的防控探究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（12）：2114-2117.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161261

2016-09-20

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-45-SYZ 17）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31560676）

張學(xué)文（1965-），男，云南永仁人，副研究員，從事蜜蜂資源、飼養(yǎng)及授粉研究工作，E-mail：zxw216226@163.com。通信作者：楊 爽，E-mail：yangshuang19860724@163.com。