張　涵，　馬　晶，　張?jiān)屏瑁垬涿?，　許慶瑞，　王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

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肺炎支原體經(jīng)ROS激活NLRP3炎性體誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β*

張涵，馬晶，張?jiān)屏瑁瑥垬涿?，許慶瑞，王偉明△

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

[摘要]目的： 觀察肺炎支原體(Mycoplasma pneunoniae，Mp)促進(jìn)NLRP3炎性體的活化及下游促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的表達(dá)是否與活性氧簇(ROS)有關(guān)。方法: 預(yù)先用5 mmol/L ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞30 min，用10 MOI Mp分別感染RAW264.7細(xì)胞4、8、16和24 h。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平；real-time PCR法檢測細(xì)胞NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達(dá)；Western blot 法檢測NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平；ELISA法檢測細(xì)胞上清液IL-1β的分泌水平。結(jié)果: 與正常組比較，感染后4、8、16和24 h模型組ROS生成顯著增加(P< 0.01)；感染后8、16和24 h模型組NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達(dá)顯著增加 (P<0.01)，感染后16和24 h NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平上調(diào)(P<0.01)，感染后24 h 細(xì)胞上清液IL-1β含量顯著增加(P< 0.01)；與模型組比較，NAC組在上述相應(yīng)時(shí)點(diǎn)ROS生成降低，NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，蛋白水平下降，細(xì)胞上清液IL-1β的含量減少。結(jié)論: Mp可能通過刺激RAW264.7細(xì)胞生成ROS而激活NLRP3炎性體。

[關(guān)鍵詞]肺炎支原體； 活性氧簇； NLRP3炎性體； 白細(xì)胞介素1β

肺炎支原體 (Mycoplasmapneunoniae，Mp) 是一種無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原核生物，不但能引起咽炎、支氣管炎、間質(zhì)性肺炎等呼吸道感染，還可引起肺外多器官病變，而且與哮喘等疾病關(guān)系密切[1-2]。其發(fā)病機(jī)制可能與Mp侵入、直接吸附及其誘發(fā)的免疫異常有關(guān)，其中免疫異常越來越受到學(xué)者的關(guān)注[3-4]。NLRP3炎性小體與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)密切相關(guān)，多種病原相關(guān)分子模式及危險(xiǎn)相關(guān)分子模式可激活炎性體，引起IL-1β等促炎細(xì)胞因子的生成，并導(dǎo)致下游炎性細(xì)胞因子的釋放[5-7]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，Mp感染早期可激活NLRP3炎性體相關(guān)基因及上調(diào)IL-1β的表達(dá)[8]。本文旨在探討Mp感染RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)NLRP3炎性體相關(guān)基因、蛋白、IL-1β的變化并探討此過程是否與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)有關(guān)。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料含CARD結(jié)構(gòu)

1.1細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞株，購自中山大學(xué)；肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC-15531) 購自ATCC。

1.2試劑與儀器PPLO培養(yǎng)基(Difico)；特級(jí)胎牛血清(杭州四季青)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco)； 燕山鮮酵母(英聯(lián)馬利北京食品銷售有限公司)；N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC；碧云天生物技術(shù)研究所)；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq均購自TaKaRa； NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)、caspase-1和HPRT引物由TaRaKa合成；NLRP3抗體、caspase-1 p20抗體和ASC抗體購自Abcam；IL-1β ELISA試劑盒(R&D)。SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)；1300 SERIES A2二級(jí)生物安全柜、3110 Series II水套式CO2培養(yǎng)箱、NANODROP 2000 核酸蛋白分析儀(Thermo)；BSP-250 生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；CFX96熒光定量PCR儀和凝膠成像儀(Bio-Rad)；Mastercycler PRO 溫度梯度 PCR 儀(Eppendorf)；GENios pro酶聯(lián)免疫檢測儀(TACAN)；Th1-200型倒置顯微鏡(Olympus)；Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將RAW264.7細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DEME培養(yǎng)液(內(nèi)含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，收獲細(xì)胞。

2.2Mp培養(yǎng)將Mp標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉用PPLO完全培養(yǎng)液(含胎牛血清、酵母提取物、酚紅、青霉素等)，充分混勻，放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察其顏色變化，待培養(yǎng)液由紅變橙黃時(shí)傳代。將處于對(duì)數(shù)生長期的Mp，CCU定量，常規(guī)凍存，待用時(shí)用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)至所需濃度。

2.3不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的Mp對(duì)細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)液，MP感染組分別按照MOI (Mp數(shù)∶細(xì)胞數(shù)) 100∶1、80∶1、40∶1、20∶1、10∶1加入Mp刺激；正常組加入等容量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。每組3復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入50 μL MTT，37 ℃孵育4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測各孔吸光度 (A) 值。

2.4分組及方法實(shí)驗(yàn)分3組，分別為正常組、Mp感染組、NAC組。取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)。孵育24 h后，小心吸棄各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，正常組加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每孔1 mL；Mp感染組：加入1×109CFU/L的Mp菌液，每孔1 mL；NAC組：加入1×109CFU/L的Mp菌液前30 min，加入5 mmol/L NAC孵育30 min。每組3復(fù)孔，分別置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4、8、16、24 h后，收集細(xì)胞或者上清液進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)收集細(xì)胞，溫PBS洗1遍，加入適量的含10 μmoL/L的DCFH的無血清培養(yǎng)基液，37 ℃避光溫育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，使探針和細(xì)胞充分接觸，離心收集細(xì)胞，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.6Real-time PCR法檢測NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)小心吸棄每孔的培養(yǎng)液，加入1 mL RNAiso Plus，吹打數(shù)次，充分裂解細(xì)胞，按RNAiso說明書提取各組細(xì)胞總RNA，A260/A280均在1.8～2.0之間。按試劑說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增。引物序列采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，NLRP3上游引物序列為5’-ACTGAAGCACCTGCTCTGCAAC-3’，下游引物序列為5’-AACCAATGCGAGATCCTGACAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為88 bp；ASC上游引物序列為5’-GCTGAGCAGCTGCAAACGA-3’，下游引物序列為5’-ACTTCTGTGACCCTGGCAATGA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為137 bp；caspase-1上游引物序列為5’-TGCCTGGTCTTGTGACTTGGA-3’，下游引物序列為5’-CCTATCAGCAGTGGGCATCTGTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為94 bp；內(nèi)參照HPRT上游引物序列為5’-TTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTA-3’，下游序列為5’-AGGCAGATGGCCACAGGACTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物189 bp。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法行PCR 產(chǎn)物相對(duì)定量分析。

2.7Western blot法檢測NLRP3炎性體相關(guān)蛋白的表達(dá)提取培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。分別取各孔樣品蛋白50 μg，經(jīng)過變性、電泳、半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在含5% BSA的TBS緩沖液中封閉1 h，分別用相應(yīng)稀釋濃度的 I 抗孵育，4 ℃過夜，TBST漂洗膜3次，用相應(yīng)的 II 抗孵育2 h，TBST漂洗膜3次，ECL法顯色蛋白條帶。

2.8ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β的水平參照試劑盒說明書操作。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1不同MOI的Mp對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

不同MOI的Mp感染RAW264.7細(xì)胞24 h，對(duì)其細(xì)胞活力均有不同程度抑制作用，其中100 MOI、80 MOI、40 MOI和20 MOI的Mp均可明顯抑制其細(xì)胞活力(P<0.05)。見圖1。

2Mp感染RAW264.7細(xì)胞ROS表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

Mp刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、16、24 h，ROS生成的水平明顯上升，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。上述時(shí)點(diǎn)，NAC可顯著下調(diào)MP感染引起的ROS表達(dá)(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.MTT assay for testing cell viability of RAW264.7 cells infected with different MOI of Mp. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同MOI的Mp對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

Figure 2.The expression of ROS in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMp group.

圖2Mp感染RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)ROS生成的變化

3Mp感染RAW264.7細(xì)胞后NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

與正常組比較，Mp刺激RAW264.7細(xì)胞8、16、24 h，均可顯著上調(diào)NLRP3、ASC和caspase-1的 mRNA表達(dá)(P<0.05)。上述時(shí)點(diǎn)，NAC可下調(diào)MP感染引起的NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMp group.

圖3Mp感染RAW264.7細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達(dá)的變化

4Mp感染RAW264.7細(xì)胞后NLRP3、ASC和caspase-1 p20蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化

與正常組比較， Mp刺激RAW264.7細(xì)胞16和24 h，均可顯著增加NLRP3、ASC和caspase-1 p20的蛋白水平(P<0.05)。上述時(shí)點(diǎn)，NAC可減低NLRP3、ASC和caspase-1 p20低蛋白水平，與模型組比較，差異顯著(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 in the RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMp group.

圖4Mp感染RAW264.7細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)NLRP3、ASC和caspase-1 p20 蛋白水平的變化

5Mp感染RAW264.7細(xì)胞后IL-1β分泌的動(dòng)態(tài)變化

Mp感染RAW264.7細(xì)胞后4、8和16 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β分泌稍有上升，但與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mp感染RAW264.7細(xì)胞24 h，可促進(jìn)IL-1β的分泌，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。與模型組比較，NAC可下調(diào)Mp感染RAW264.7細(xì)胞24 h的IL-1β表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The concentration of IL-1β in the supernatant of cultured RAW264.7 cells infected with Mp. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMp group.

圖5Mp感染RAW264.7細(xì)胞后不同時(shí)點(diǎn)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β含量的變化

討論

NLRP3炎性體是由NLRP3、接頭蛋白(ASC)及caspase-1前體組成的一類大分子多蛋白復(fù)合體，屬于NOD樣受體家族成員，是機(jī)體胞漿中重要的模式識(shí)別受體。NLRP3可識(shí)別機(jī)體自身危險(xiǎn)信號(hào)及細(xì)菌等外源性危險(xiǎn)信號(hào)，當(dāng)其被激活后，通過接頭蛋白ASC招募caspase-1前體，使其水解，產(chǎn)生 p20和p10大小亞基，形成p20/p10異二聚體，再形成4聚體，即有活性的caspase-1，進(jìn)而對(duì)IL-1β、IL-18等前體進(jìn)行剪切，促進(jìn)有生物活性的IL-1β和IL-18釋放至細(xì)胞外，參與炎癥反應(yīng)[5, 9]。金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌、呼吸道合胞病毒等多種病原微生物均可通過直接或者間接途徑激活NLRP3炎性體[10-12]。其激活機(jī)制尚不完全明確，目前有半通道模型、溶酶體破壞模型及ROS模型等3種假說[13]。

Mp為一類無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，大小介于細(xì)菌和病毒之間的原核微生物，是兒童及青少年時(shí)期社區(qū)獲得性肺炎的最常見病原體，可引起間質(zhì)性肺炎及細(xì)支氣管炎[4, 14]。研究表明，肺炎支原體肺炎與機(jī)體免疫異常有關(guān)，肺炎支原體感染機(jī)體時(shí)，能否激活NLRP3炎性體？激活途徑如何，鮮有報(bào)道。

我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Mp感染RAW264.7細(xì)胞早期，不同MOI的Mp可激活NLRP3炎性體相關(guān)基因表達(dá)，其100 MOI的Mp可促進(jìn)IL-1β的分泌[8]。為了進(jìn)一步探討Mp的感染對(duì)NLRP3炎性體及IL-1β表達(dá)的影響及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，選用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型，首先考察了不同MOI的Mp與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h對(duì)其細(xì)胞活力的影響，以選擇合適MOI的Mp復(fù)制模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：10 MOI的Mp與此細(xì)胞共同孵育24 h，對(duì)其細(xì)胞活力無明顯影響。在此基礎(chǔ)上，本研究探討了10 MOI的 Mp感染RAW264.7細(xì)胞4、8、16和24 h 4個(gè)時(shí)點(diǎn)NLRP3炎性體相關(guān)基因及蛋白以及IL-1β的動(dòng)態(tài)變化，并用ROS抑制劑NAC為干預(yù)因素，以觀察ROS是否參與了此過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mp感染RAW264.7細(xì)胞4 h，ROS生成增加，感染8 h時(shí)，NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表達(dá)上調(diào)；感染16 h NLRP3、ASC及胞漿內(nèi)caspase-1的活化形式caspase-1 p20蛋白表達(dá)上調(diào)，感染24 h時(shí)，IL-1β表達(dá)上調(diào)，即NLRP3炎性體可能參與了Mp的炎癥反應(yīng)，且Mp感染RAW264.7細(xì)胞后NLRP3炎性體的上游和下游因子變化的時(shí)點(diǎn)不相同。ROS的抑制劑NAC作用Mp感染的RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降，NLRP3炎性體相關(guān)基因、蛋白及IL-1β表達(dá)均下調(diào)，即ROS可能參與了Mp激活NLRP3炎性體的過程，此激活過程是ROS單獨(dú)參與還是與其它因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步在動(dòng)物模型中加以研究和驗(yàn)證。本研究為肺炎支原體肺炎的發(fā)病機(jī)制研究和藥物治療提供了新的思路。

(致謝：感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所及中醫(yī)內(nèi)科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室在儀器使用中給予的幫助。)

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.KY2015LX280)；桂林醫(yī)學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)基金(No.KY2012087)

Mycoplasmapneumoniaeinduces IL-1β production through activating NLRP3 inflammasome by ROS in RAW264.7 cellsZHANG Han, MA Jing, ZHANG Yun-ling, ZHANG Shu-ming, XU Qing-rui, WANG Wei-ming

(HeilongjiangProvincialAcademyofSciencesofTCM,Haerbin150036,China.E-mail:wmzyyjy@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate whether Mycoplasma pneumoniae (Mp)-induced interleukin-1β (IL-1β) production in RAW264.7 cells is through the activation of NLRP3 inflammasome via reactive oxygen species (ROS). ME-THODS: RAW264.7 cells were randomly divided into 3 groups. In normal group, RAW264.7 cells were treated without Mp. In model group, RAW264.7 cells were treated with 1∶10 multiplicity of infection (MOI) of Mp. In NAC group, RAW264.7 cells were pretreated with N- acetylcysteine (NAC) at a concentration of 5 mmol/L for 30 min before infection with Mp. The RAW264.7cells were infected with Mp (1∶10 MOI) for 4, 8, 16 and 24 h in model group and NAC group, respectively. The intracellular ROS level was analyzed by flow cytometry. The mRNA expressions of NLRP3, ASC and caspase-1 were detected by real-time PCR. The protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 were determined by Western blot. The levels of pro-inflammatory cytokine IL-1β in the supernatant were measured by ELISA. RESULTS: Compared with normal group, the production of ROS were significantly increased at 4, 8, 16 and 24 h after infection, the mRNA expression of NLRP3, ASC and caspase-1 were increased at 8, 16 and 24 h after infection, the protein levels of NLRP3, ASC and caspase-1 p20 were increased at 16 and 24 h after infection, and the releases of IL-1β were increased at 24 h after infection in model group (P<0.01). Compared with the model group, the level of ROS in NAC group decreased, so as the expression of NLRP3, ASC and caspase-1 at mRNA and protein levels and the releases of IL-1β in the supernatant at the corresponding time points. CONCLUSION: Mp may stimulate the ROS production to activate NLRP3 inflammasome in RAW264.7 cells.

[KEY WORDS]Mycoplasma pneumoniae; Reactive oxygen species; NLRP3 inflammasome; Interleukin-1β

通訊作者△Tel: 0773-5895291; E-mail: 31910753@qq.com

[收稿日期]2015- 05- 21[修回日期] 2015- 09- 14

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2249- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.022

[中圖分類號(hào)]363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A