★　沈海英　鮑方名　顧珉　張國林　黃依雯　李倩　(蘇州市食品藥品檢驗所　江蘇 蘇州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥材的分子生物學鑒定和藥品微生物檢驗。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。

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中藥飲片鹿血晶PCR檢測方法的建立

★沈海英*鮑方名顧珉張國林黃依雯李倩(蘇州市食品藥品檢驗所江蘇 蘇州 215004)

*第一作者：沈海英(1980—)，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥材的分子生物學鑒定和藥品微生物檢驗。Tel:13814858420；E-mail:shenhaiyingfey@126.com。

摘要：目的：為中藥飲片鹿血晶的鑒別，建立PCR檢測方法。方法：分別提取鹿血、牛血、豬血、鹿血晶和它們的混合物的基因組，然后加入相應(yīng)的引物進行PCR擴增和產(chǎn)物檢測。結(jié)果：用鹿、牛和豬的全血提取基因組后進行PCR擴增，擴增后它們各自PCR產(chǎn)物的大小分別為鹿408bp,牛271bp和豬149bp；用鹿特異性引物，擴增不同動物血液來源基因組，結(jié)果顯示該引物對鹿血具有特異性。選取市場上兩個生產(chǎn)廠家的鹿血晶，經(jīng)PCR檢測，均檢出鹿特異性目的條帶。結(jié)論：用PCR的方法鑒別中藥飲片鹿血晶的真?zhèn)?，是一種客觀可靠的方法。

關(guān)鍵詞：中藥飲片；鹿血晶；PCR；鑒別

目前市場上含有鹿血的保健品有十幾個品種，但是由于鹿血來源稀少及其珍貴的藥用價值，所以市場上鹿血成分魚目混珠，常用比較廉價的豬血、羊血、牛血等動物血以假亂真。傳統(tǒng)的方法無法區(qū)分動物血的來源。DNA核酸序列和特異引物PCR擴增在動物藥材鹿茸、鹿鞭、烏梢蛇、龜板、土鱉蟲、蜈蚣等鑒定方面都取得了良好效果[1]，但其在鹿血來源的應(yīng)用還無相關(guān)報道。因此本研究為了鑒別中藥飲片鹿血晶的真?zhèn)危CR檢測方法。

1材料和方法

1.1試劑DNA提取試劑盒(天根：TIANamp Genomic DNA Kit,吸附柱批號：M1104)；DREAM Taq Green Pcr Master Mix(2×)12.5μL(Thermo Scientific，批號:00108596)；引物序列見表1，由上海生工合成。

表1　鹿、牛、豬PCR檢測引物信息表

1.2藥材梅花鹿血、牛血、豬血(由蘇州市紅冠莊國藥飲片有限公司提供)；鹿血晶1購于蘇州市紅冠莊國藥飲片有限公司(批號：1211022)；鹿血晶2購于合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司(批號：12040102)。

1.3實驗儀器高速低溫離心機：Thermo scientific Biofuge primo R；凝膠成像系統(tǒng)：GEL DocTM XR+ Bio RAD；電泳儀：Bio-RAD Power Pac TM Basic；PCR儀：AB AppLied Biosystems。

1.4方法

1.4.1模板DNA提取按試劑盒使用說明提取鹿血(鹿全血約50μL)、牛血(牛全血約50μL)、豬血(豬全血約50μL)和鹿血晶(約15mg)的基因組DNA。

1.4.2PCR反應(yīng)體系在200 μL離心管中進行，反應(yīng)總體積為25 μL,DREAM Taq Green Pcr Master Mix (2×) 12.5 μL(Thermo Scientific，批號：00108596)，20μM的引物各0.75 μL，DNA模板1.25 μL，去離子水9.75 μL。陰性對照為滅菌去離子水。陰性對照試驗除反應(yīng)中不加模板DNA外，均按上述測定條件和步驟進行。

1.4.3PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)見表2。

1.4.4電泳檢測稱取適量的瓊脂糖加入1×TAE緩沖液中，配置成質(zhì)量濃度為1.5%的溶液，加熱溶解，稍加冷卻后，加入GeLRed溶液至終濃度為0.1μg/mL。制膠時將凝膠倒入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中，垂直向上拔去梳版。吸取5～8μLPCR擴增產(chǎn)物點樣。其中一個泳道中加入DNA分子量標準品3～6μL作用(按試劑說明確定加樣量)，接通電源電泳，按5V/cm的電壓電泳30～60min。紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。

表2　3種動物基因PCR反應(yīng)參數(shù)

1.4.5結(jié)果判斷凝膠電泳圖譜中，待測鹿血晶在與梅花鹿血液對照品凝膠電泳圖譜相應(yīng)的位置上(408bp)，有單一DNA條帶為正品。

2結(jié)果

2.1采用文獻報道的鹿、牛和豬特異性基因片段引物，用鹿、牛和豬的全血提取基因組后進行PCR擴增，擴增后電泳結(jié)果見圖1。它們各自PCR產(chǎn)物的大小分別為鹿408bp,牛271bp和豬149bp。

1.鹿血；2.牛血；3.豬血；4.陰性對照；5.DNA marker

2.2用鹿特異性引物，擴增不同動物血液來源基因組結(jié)果見圖2。可見該引物對鹿血具有特異性。其不能擴增出牛和豬血的特異性條帶，而對鹿血和鹿血與其它動物血的混合物(兩者1∶1混合)，能擴增出特異性條帶。

1.鹿血；2.牛血；3.豬血；4.牛血+鹿血；

1.鹿血；2.鹿血晶1；3.鹿血晶2；4.陰性對照；5.DNA marker

1.DNA marker；2.鹿血晶量：29.75mg;3.鹿血晶量:15.25mg;

2.3不同來源鹿血晶PCR擴增結(jié)果見圖3。選取市場上兩個生產(chǎn)廠家的鹿血晶，經(jīng)PCR檢測，均檢出鹿特異性目的條帶。

2.4不同含量鹿血晶PCR擴增結(jié)果見圖4。稱取不同量的鹿血晶，進行基因組DNA提取，提取后進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)當鹿血晶的含量為1.51mg時(為常規(guī)用量十分之一左右)仍能擴增出目的條帶。

3討論

中藥飲片鹿血晶為純梅花鹿或馬鹿血制成，其性熱、味甘咸，具有養(yǎng)血益精，行血祛瘀、消腫療傷等作用[4]?，F(xiàn)代研究表明，鹿血制品含有豐富的造血干細胞和多種造血因子，包括G-CSF、GM-CSR、M-CSF等。目前市場上鹿血成分魚目混珠。有關(guān)鹿血的鑒別，雖然有免疫學抗原抗體沉淀法、聚丙酰胺凝膠電泳等方法報道，但由于方法繁瑣等原因，這些方法未能得到廣泛應(yīng)用[5]。

本研究選用的引物，針對《中華人民共和國藥典》規(guī)定其正品為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的線粒體基因設(shè)計，對鹿血基因組DNA進行PCR擴增，可以得到預(yù)期大小的目的片段；兩批市售鹿血晶飲片檢出和鹿血大小一致的目的片段；對牛血、豬血基因組DNA進行PCR擴增，未得到預(yù)期大小的目的片段；對不同含量鹿血晶PCR擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)當鹿血晶的含量為1.51mg時(約為常規(guī)用量15mg左右的十分之一)仍能擴增出目的條帶。故對樣品DNA提取液進行鹿內(nèi)源基因的PCR擴增，以鹿基因組DNA作為陽性對照，如陰性對照未出現(xiàn)擴增條帶，陽性對照和待測樣品均出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，則可初步判斷待測樣品含有鹿源性成分。如待測樣品未出現(xiàn)PCR擴增產(chǎn)物，則可判斷待測樣品不含鹿源性成分(或極其微量)。

本方法的局限性：1)只能檢測出是否含有鹿血成分，無法對其含量進行測定。2)根據(jù)文獻報道，本研究選用的鹿引物是針對梅花鹿和馬鹿，而對其他品系鹿血的樣品是否可以分辨，由于取材困難，本文未做相應(yīng)的探討。3)本研究只探討了鹿血晶常見偽品血來源豬血和牛血對該方法檢測不具有干擾，而該方法對其他鹿血晶偽品血是否能有效檢出，有待于進一步研究。

參考文獻

[1]白根本，張林源，劉春生，等.鹿源類中藥材DNA序列分析及馬鹿和梅花鹿的PCR鑒定[J].中草藥，2006，37(10)：1 566-1 569.

[2]劉向華，王義權(quán)，周開亞，等.鹿類中藥材的位點特異性PCR鑒定研究[J].藥學學報，2001，36(8)：631-635.

[3]武艷軍，劉思國，陳建泉，等.PCR方法鑒別動物血球蛋白粉的來源[J].飼料工業(yè)，2009，30(7):33-35.

[4]孫紅，李占東，薛冬，等.中藥鹿血晶治療化療后血小板減少癥的臨床觀察[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2012，12(9)：832-833.

[5]郭月秋，陳代賢，劉輝，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別鹿血與其它動物血[J].時珍國醫(yī)國藥，2000，11(3)：232.

收稿日期：(2015-06-10)編輯：翟興英

中圖分類號：R286

文獻標識碼：B