★　吳莉　江偉　劉永忠　(.上高縣人民醫(yī)院　江西 上高 336400；.江西中醫(yī)藥大學(xué)　南昌 330006)

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RP-HPLC法測(cè)定知柏地黃丸中熊果酸含量

★吳莉1江偉1劉永忠2(1.上高縣人民醫(yī)院江西 上高 336400；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330006)

摘要：目的：對(duì)知柏地黃丸中熊果酸的含量進(jìn)行快速測(cè)定。方法：采用反向高效液相色譜法(RP-HPLC法)測(cè)定。結(jié)果：熊果酸在0.50μg/mL～10.00μg/mL間具有良好的線性關(guān)系(r=0.9985,n=6)，平均加樣回收率為100.19%，RSD為0.67%(n=6)。結(jié)論：該方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便。

關(guān)鍵詞：RP-HPLC；知柏地黃丸；熊果酸；含量測(cè)定

知柏地黃丸來(lái)源于清代吳謙主編《醫(yī)宗金鑒》，由知母、黃柏、熟地黃、山藥、山茱萸(制)、牡丹皮、茯苓、澤瀉組成，輔料為蜂蜜，有滋陰清熱功效，用于潮熱盜汗，耳鳴遺精，口干咽燥[1]。組方中山茱萸(制)的主要成分有熊果酸、山茱萸苷、酒石酸、沒(méi)食子酸等，中國(guó)藥典2010版采用薄層色譜法對(duì)知柏地黃丸進(jìn)行鑒別(以丹皮酚為對(duì)照品)，其含量測(cè)定采用高效液相色譜法測(cè)定山茱萸(以馬錢(qián)苷計(jì))和牡丹皮(以丹皮酚計(jì))的含量[2]，實(shí)際應(yīng)用中該法檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作繁瑣而且誤差較大。為了摸索一種更快捷和有效的檢測(cè)知柏地黃丸質(zhì)量方法，本文采用反向高效液相色譜法(RP-HPLC法)測(cè)定知柏地黃丸中山茱萸有效成分熊果酸的含量。

1儀器與試藥

儀器:LC-20A島津高效液相色譜儀Prominence LC-20A(日本),包括：自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測(cè)器、四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、G1314B VWD紫外檢測(cè)器；KQ-250VDB型雙頻數(shù)顯超聲機(jī)(功率:200W,頻率:40KHz，昆山市超聲儀器有限公司)；色譜工作站(系統(tǒng)控制器Prominence CBM-20A/20ALite)；Sartorius BS124S電子分析天平。甲醇為色譜純,乙腈(分析純),水為重蒸餾水(自制)。對(duì)照品：熊果酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):1107422200314)；知柏地黃丸(濃縮丸)：江西藥都樟樹(shù)制藥有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字Z36021779,批號(hào)：Z20130518)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱:VenusiLXBP-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.1%氨水溶液(磷酸調(diào)pH～9.0)，其比例為(50∶50∶0.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm；流速為1.0mL/min;柱溫為30℃；峰面積外標(biāo)法定量[3]。

2.2對(duì)照品溶液的制備取熊果酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)量，置25mL棕色量瓶中，加甲醇-乙腈溶液(4∶1)，制成每1mL含0.1mg熊果酸的溶液,搖勻即得。

2.3供試液的制備取知柏地黃丸適量，仔細(xì)研細(xì),精密稱(chēng)定1.0g,置具塞25mL錐形瓶中,加入甲醇-0.1%氨水溶液(20∶1)約20mL,密塞，超聲振蕩0.5h(功率100w,頻率40kHz)，放冷,再加入甲醇-0.1%氨水溶液(20∶1)精密稱(chēng)定重量,搖勻,取續(xù)濾液用0.22μm微孔濾膜濾過(guò),即得[3]。

2.4檢測(cè)波長(zhǎng)取適量熊果酸對(duì)照品，用流動(dòng)相(甲醇-乙腈-0.1%氨水溶液，pH～9.0)配成溶液，在150～300nm紫外光區(qū)內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，熊果酸在205nm附近有最大吸收峰，因甲醇在204nm左右有很強(qiáng)的吸收，影響可變波長(zhǎng)檢測(cè)器紫外檢測(cè)光譜，所以選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取供試液20μL進(jìn)樣，分別于0，2，4，6，8，10，12h按色譜條件測(cè)定峰面積值，RSD=1.11%，結(jié)果顯示供試液12h色譜峰面積無(wú)明顯變化，說(shuō)明供試液在12h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.6系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)按熊果酸計(jì)算理論塔板數(shù)10500，熊果酸與相鄰峰的分離度大于1.5[4]，拖尾因子在0.95～1.05之間。表明樣品中其他成分對(duì)熊果酸的測(cè)定無(wú)干擾。熊果酸的保留時(shí)間為18.5min。

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對(duì)照品溶液0.5，1，2，4，6，8，10mL，分別置于10mL量瓶中，加入甲醇-乙腈(4∶1)稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜?0mL，即得系列不同濃度的對(duì)照品溶液。分別吸取上述對(duì)照品溶液各20μL(n=6)注入色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到熊果酸的回歸方程為Y=28.8921X-2.415，r=0.9985，線性范圍為0.50～10.00μg/mL，可見(jiàn)線性關(guān)系良好。

2.8精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取3.3中中間濃度的對(duì)照液20μL，在上述的色譜條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，按照色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算偏差，得RSD=0.96%。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取已測(cè)含量的知柏地黃丸(濃縮丸)6份，每份約0.5g，加入熊果酸對(duì)照品溶液，置具塞25mL錐形瓶中密塞，稱(chēng)定重量，按供試品溶液的制備方法制備。在上述的色譜測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得熊果酸的回收率平均為100.19%，RSD為0.67%。

3樣品含量測(cè)定

取供試液(n=8)，按照本文色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法進(jìn)行含量計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　知柏地黃丸含量測(cè)定結(jié)果濃度　　(mg·g-1)

4討論

用甲醇-乙腈(4∶1)進(jìn)行配制的對(duì)照品溶液經(jīng)過(guò)紫外掃描可知，熊果酸在205nm附近有最大吸收峰，因甲醇在204nm左右有很強(qiáng)的吸收，影響可變波長(zhǎng)檢測(cè)器紫外檢測(cè)光譜，為避開(kāi)甲醇的干擾，所以選擇210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)前期做了供試品的制備方法的對(duì)比，即超聲和回流，分別進(jìn)行制備30min，結(jié)果顯示超聲操作得到的含量最高；同時(shí)對(duì)超聲時(shí)間也進(jìn)行了比較，分別采用20,30,40,50min超聲，結(jié)果顯示30min提取效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲30min方法制備供試品。

山茱萸中同時(shí)含有齊墩果酸和熊果酸，但由于多種原因，本次實(shí)驗(yàn)未對(duì)齊墩果酸進(jìn)行含量測(cè)定，今后實(shí)驗(yàn)應(yīng)同時(shí)對(duì)山茱萸中齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行含量測(cè)定，使得知柏地黃丸質(zhì)量得到更好控制。

參考文獻(xiàn)

[1]程兆盛.現(xiàn)代中成藥[M].南昌：江西科技出版社，1997(6)：408.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010：109.

[3]鄭琴，郝偉偉，楊明，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定止痛方提取物中6種成分的含量[J].藥物分析雜志，2011(31):1 269.

[4]劉煒，吳義忠.健胃消食片中熊果酸的含量測(cè)定[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010,4(1)：5-6.

新專(zhuān)欄征稿

《江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》(雙月刊)已全面改版，以下重點(diǎn)欄目面向全國(guó)征稿：

●旴江醫(yī)學(xué)本欄目征集與江西旴江醫(yī)學(xué)相關(guān)的臨床、藥學(xué)、養(yǎng)生、文化等各類(lèi)研究論文。旴江醫(yī)學(xué)地域涉及廣昌、南豐、南城、黎川、資溪、金溪、樂(lè)安、宜黃、崇仁、臨川、東鄉(xiāng)、豐城、清江(樟樹(shù))、進(jìn)賢、新建、南昌等縣市。旴江醫(yī)學(xué)人物包括祖籍在旴江流域以及在該流域有醫(yī)事(藥事)活動(dòng)的醫(yī)家和文化名人。

●理論研究對(duì)中醫(yī)重大理論問(wèn)題進(jìn)行專(zhuān)題論述。討論專(zhuān)題有：中醫(yī)水理論研究、火理論研究、體質(zhì)學(xué)說(shuō)研究、夢(mèng)理論研究、病證理論研究。

●百家爭(zhēng)鳴旨在打破中醫(yī)學(xué)術(shù)界的沉悶局面，對(duì)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展的重大問(wèn)題展開(kāi)討論爭(zhēng)鳴。爭(zhēng)鳴要求堅(jiān)持良好的學(xué)術(shù)道德，敢說(shuō)真話，敢亮觀點(diǎn)。爭(zhēng)鳴的主要內(nèi)容有：中醫(yī)教育反思、中醫(yī)科研走向、中醫(yī)發(fā)展前景、中西醫(yī)結(jié)合前景、新時(shí)期中醫(yī)的生存模式等。

●中醫(yī)文化研究主要反映中醫(yī)與古代哲學(xué)、古代社會(huì)政治經(jīng)濟(jì)、人文地理等文化形態(tài)的研究成果以及五運(yùn)六氣研究、生命學(xué)說(shuō)研究的最新動(dòng)態(tài)。

●道教醫(yī)學(xué)研究包括道教醫(yī)藥文獻(xiàn)研究、道教醫(yī)藥人物研究、道教醫(yī)藥史研究、道教醫(yī)學(xué)理論研究、道教醫(yī)學(xué)方藥研究、道教醫(yī)學(xué)養(yǎng)生研究等，要求觀點(diǎn)正確，不違背國(guó)家宗教政策。

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收稿日期：(2015-07-07)編輯：翟興英

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B