劉紅林（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院袁江蘇南京210095）

?

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)

劉紅林
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院袁江蘇南京210095）

摘要院所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指基因組整合有外源基因袁并且能將外源基因穩(wěn)定遺傳給后代的一類動(dòng)物遙本文簡要介紹了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)的受精卵原核顯微注射法堯干細(xì)胞嵌合體法堯體細(xì)胞克隆法和病毒載體法四種主要技術(shù)的原理堯方法及優(yōu)缺點(diǎn)遙

關(guān)鍵詞院轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；制備技術(shù)

所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指基因組整合有外源基因，并且能將外源基因穩(wěn)定遺傳給后代的一類動(dòng)物。

在物種的形成與進(jìn)化過程中，基因交流一直在發(fā)生。研究認(rèn)為，哺乳動(dòng)物線粒體可能來源于古細(xì)菌，而基因組中的原癌基因序列可能源自于病毒DNA；另一方面，一個(gè)種群也會(huì)通過雜交方式摻入其他種群的血緣，如無氟烷基因皮特蘭豬種的建立。皮特蘭豬種是世界上瘦肉率最高的豬種，但具有引發(fā)應(yīng)激綜合征的有害氟烷基因，氟烷基因是蘭尼定受體基因的一種突變類型，在皮特蘭豬種純合。商業(yè)化去除皮特蘭豬種氟烷基因的策略是：將皮特蘭豬與大白豬雜交，雜種豬為具有1個(gè)氟烷基因和1個(gè)正確蘭尼定受體基因的雜合子，繼而將雜種豬與皮特蘭豬回交，回交1代豬有一半為氟烷基因雜合子，采用分子生物學(xué)技術(shù)選出雜合子豬，再將雜合子豬與皮特蘭豬回交，選出后代豬群中的雜合子再與皮特蘭回交，這樣經(jīng)過多代回交，最終的回交豬群皮特蘭豬種的血緣可以超過97%，回交豬群的雜合子豬自交，后代約有1/4不含氟烷基因，采用分子生物學(xué)技術(shù)將其選出，就可獲得無氟烷基因的皮特蘭豬新種群，從而在皮特蘭新豬群中成功用大白豬的蘭尼定受體基因替代了有害氟烷基因。與傳統(tǒng)的基因交流不同，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用分子分物學(xué)技術(shù)將少數(shù)或個(gè)別基因?qū)胨拗骰蚪M，而且外源基因的來源更加廣泛，如將線蟲的fat-1基因?qū)胴i基因組。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備技術(shù)可以歸納為以下四種主要的類型：受精卵原核顯微注射法、干細(xì)胞嵌合體法、體細(xì)胞克隆法和病毒載體法，現(xiàn)將此四種技術(shù)方法分別介紹如下。

1　受精卵原核注射法

對(duì)于有性生殖的動(dòng)物來說，生命起源于單細(xì)胞受精卵，構(gòu)成動(dòng)物有機(jī)體多種多樣的細(xì)胞擁有一個(gè)共同的祖先細(xì)胞，即受精卵。生命初期，精子與卵子融合形成受精卵，在受精卵細(xì)胞質(zhì)中精子與卵子的遺傳物質(zhì)分別形成雄原核和雌原核，十多個(gè)小時(shí)后受精卵進(jìn)入有絲分裂中期，此時(shí)精子與卵子的遺傳物質(zhì)才混合在一起。雌、雄原核雖然處于同一個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，但兩者有許多不同，最易觀察的是兩者體積存在差異，雄原核體積較大。受精卵原核注射法即采用顯微技術(shù)將外源基因注入雄原核。實(shí)踐證明，注入雄原核的外源基因會(huì)整合進(jìn)入部分胚胎的基因組中，從而在后代中獲得一定比例的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。受精卵原核注射法是應(yīng)用最為廣泛，也是最早、最經(jīng)典的方法，其優(yōu)點(diǎn)是：導(dǎo)入過程直觀、外源基因（DNA）的大小不受限制、沒有化學(xué)試劑等對(duì)細(xì)胞的毒性作用；缺點(diǎn)也比較明顯：需要昂貴的設(shè)備與技術(shù)難度很大的復(fù)雜操作，胚胎因受到的機(jī)械損傷較大而存活率下降，外源基因隨機(jī)整合，導(dǎo)入基因沉默現(xiàn)象多有發(fā)生，效率較低。

2　干細(xì)胞嵌合體法

動(dòng)物胚胎附植前發(fā)育存在一個(gè)被稱為囊胚期的發(fā)育階段，小鼠受精卵大約經(jīng)過3～4天的發(fā)育進(jìn)入囊胚期，囊胚是中空的球狀結(jié)構(gòu)，由外周滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)部的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞組成，滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育成胎盤，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育成胚體。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞具有分化形成動(dòng)物有機(jī)體多種多樣細(xì)胞類型的能力，被稱為多能性胚胎干細(xì)胞。同一物種不同類群的動(dòng)物，其囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)混合后能夠發(fā)育成被稱為嵌合體的個(gè)體，所謂嵌合體是指組成動(dòng)物有機(jī)體的細(xì)胞有2個(gè)或2個(gè)以上的祖先細(xì)胞來源。不同物種的嵌合體也有報(bào)道，典型的例子是2002年國際期刊《家禽科學(xué)》的一篇報(bào)道，該報(bào)道稱，鴨的胚盤細(xì)胞注入雞胚盤下腔，能夠發(fā)育形成混有鴨細(xì)胞的嵌合體雞，并且鴨細(xì)胞可以參與嵌合體雞生殖腺的形成，在嵌合體雞精液中檢測到鴨精子，嵌合體雞精液能使母鴨受精，獲得后代鴨。干細(xì)胞嵌合體法的原理是：體外將外源基因轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞基因組，然后將轉(zhuǎn)有外源基因的胚胎干細(xì)胞注射到正常胚胎的囊胚腔，在后代嵌合體中檢測生殖嵌合的個(gè)體，在生殖嵌合個(gè)體與正常動(dòng)物個(gè)體繁殖的后代中，將產(chǎn)生一定比例的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。該方法突出的優(yōu)點(diǎn)是：只需將外源基因?qū)敫杉?xì)胞，外源基因整合情況的可控性高。與將外源基因?qū)雮€(gè)體相比，外源基因?qū)爰?xì)胞的方法多樣、簡單易行，且通過對(duì)外源基因在宿主細(xì)胞基因組插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)以及表達(dá)特性的檢測，可以篩選出適合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞類型，從而提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物類型的可控性。但一方面由于大動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ES細(xì)胞）建系困難，限制了該技術(shù)方法的應(yīng)用；另一方面，利用該法獲得的第一代動(dòng)物均為嵌合體，獲得真正的轉(zhuǎn)基因個(gè)體的試驗(yàn)周期長、效率低。

3　體細(xì)胞克隆法

體細(xì)胞克隆的成功是生殖生物學(xué)的重大變革，意義深遠(yuǎn)。高度分化的體細(xì)胞，如皮膚細(xì)胞，植入去核的卵母細(xì)胞后體細(xì)胞核發(fā)生去分化，成為類似受精卵的全能性細(xì)胞。體細(xì)胞移入去核卵母細(xì)胞后，經(jīng)人工激活可以重演早期胚胎的發(fā)育過程，移植代孕動(dòng)物可以生出具有繁殖性能的個(gè)體。如果體細(xì)胞導(dǎo)入了外源基因，那么克隆后代同時(shí)也就是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。借助體細(xì)胞克隆法已先后獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠、豬、牛、羊等動(dòng)物。體細(xì)胞克隆法適用于大多數(shù)物種，且試驗(yàn)周期短，無需進(jìn)行嵌合體育種就可直接獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體；不足之處是實(shí)驗(yàn)操作難度大及克隆的成功率較低。

4　病毒載體法

病毒，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有感染細(xì)胞并將自身DNA整合進(jìn)入宿主基因組的能力。病毒感染細(xì)胞的一個(gè)重要方面是將其遺傳物質(zhì)釋放進(jìn)入細(xì)胞，病毒DNA具有長末端重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特征，借助這種結(jié)構(gòu)特征，病毒DNA可以高效整合到宿主細(xì)胞基因組。病毒DNA的長末端重復(fù)序列具有啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄的功能，將外源基因置于長末端重復(fù)序列下游重組病毒DNA，由此生產(chǎn)的病毒感染受精卵或早期胚胎后，就有可能獲得轉(zhuǎn)基因嵌合體后代，再經(jīng)過一代繁殖得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在各種基因轉(zhuǎn)移的方法中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因整合入宿主細(xì)胞基因組，是最為有效的方法之一，其中慢病毒載體以其高效的整合與表達(dá)效率受到特別注意。2002年《科學(xué)》雜志報(bào)道，重組的慢病毒顆粒注射小鼠受精卵透明帶與細(xì)胞膜間的卵周隙，能夠高效獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后1～2年，利用該種載體相繼高效獲得了轉(zhuǎn)基因大鼠、牛、豬等。慢病毒載體法特別適用于家禽的轉(zhuǎn)基因個(gè)體制備，禽類由于其繁殖生物學(xué)特點(diǎn)，適用于哺乳動(dòng)物的多種轉(zhuǎn)基因制備技術(shù)（如原核注射法、干細(xì)胞嵌合體法、體細(xì)胞克隆法）均難以在家禽上借用。對(duì)家禽而言，只需在新生受精蛋的胚盤下腔注入重組有外源基因的慢病毒載體，就能高效獲得轉(zhuǎn)基因雞嵌合體，并且生殖嵌合的比率高。慢病毒載體法以其簡單、高效成為轉(zhuǎn)基因禽制備的首選技術(shù)。與其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，病毒載體法操作簡單，外源基因的整合效率高；但該方法對(duì)外源基因片段的大小有限制，生殖嵌合的比率較低，并且存在病毒載體可能激活基因組的原癌基因或其他有害基因的生物安全隱患。

中圖分類號(hào)院S828.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼院A

文章編號(hào)院1673-4645(2016)04-0060-02

收稿日期：2016-03-30

基金項(xiàng)目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08006-003）

作者簡介：劉紅林（1966-），漢族，江蘇姜堰市人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail：liuhonglin@njau.edu.cn