王崇宇　劉苗生

(舟山旅游與健康職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，浙江　舟山　316111)

?

肺癌組織中miRNA-34a表達對肺癌細胞系A(chǔ)549增殖和遷移的影響

王崇宇劉苗生

(舟山旅游與健康職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，浙江舟山316111)

〔摘要〕目的探討肺癌組織中微小RNA(miR)-34a的表達情況及其對肺癌細胞系A(chǔ)549增殖和遷移的影響。方法RT-PCR方法檢測miR-34a在肺癌組織和肺癌細胞系A(chǔ)549中的表達情況?？寺⌒纬蓪嶒灆z測miR-34a對肺癌細胞系A(chǔ)549增殖能力的影響；劃痕實驗檢測miR-34a對肺癌細胞系A(chǔ)549遷移能力的影響。TargetScans軟件預(yù)測miR-34a可能的靶基因，并采用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C預(yù)測的靶基因。Western印跡方法檢測miR-34a對預(yù)測靶基因表達的影響。結(jié)果miR-34a在肺癌組織和肺癌細胞系A(chǔ)549中的表達較正常組織顯著降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-34a可顯著抑制A549細胞的增殖和遷移能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-34a 抑制劑可增加A549細胞的增殖和遷移能力(P<0.01)。Target Scans軟件預(yù)測miR-34a可能的靶基因為B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)，且得到熒光素報告實驗結(jié)果證實。Western印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-34a可顯著抑制A549細胞中Bcl-2的表達(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-34a 抑制劑可增加A549細胞中Bcl-2的表達(P<0.01)。結(jié)論miR-34a可通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達而發(fā)揮肺癌抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕肺癌；miR-34a；靶基因；Bcl-2

第一作者：王崇宇(1960-)，女，副教授，主要從事腫瘤病理研究。

80%的肺癌均為非小細胞肺癌(NSCLC)〔1〕。據(jù)此，NSCLC的發(fā)生發(fā)展情況可在一定的過程度上反映肺癌的發(fā)生發(fā)展情況。NSCLC的發(fā)生不僅與p53、Rb和Ras等蛋白質(zhì)基因編碼異常有關(guān)〔2〕，還與多種微小RNA(miRNA)表達異常有關(guān)〔3〕。miR-34a已證實在多種腫瘤組織中存在異常表達，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4～6〕。然而，關(guān)于miR-34a調(diào)節(jié)NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制目前尚不清楚。本研究檢測miR-34a對B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白表達水平的影響，旨在探討miR-34a在NSCLC進展中的作用及相關(guān)機制。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2011年6月至2013年12月我院胸科收治的NSCLC患者40例。術(shù)前均未接受化療和放療。年齡53～76歲〔平均(64.15±6.69)〕歲。NSCLS組織標本取自手術(shù)切除的原發(fā)腫瘤組織，同時收集切緣附近正常組織作為實驗對照。正常組織需于術(shù)后經(jīng)病理醫(yī)生證實無癌組織侵犯。

1.2細胞及主要試劑NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心，A549培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司；轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza公司；TRIzol、miR-34a、陰性對照(NC)、anti-miR-NC和anti-miR-34a購自美國Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購自Ambion公司；熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；Bcl-2抗體購自美國Abcam公司。

1.3熒光定量PCRTrizol提取A549總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物序列：miR-34a上游引物：5'-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3'，下游引物：5'-GGCATCTCTCGCTTCATCTT-3'；內(nèi)參照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。得到的數(shù)據(jù)通過比較CT值法(2-△△Ct)進行定量分析。

1.4方法(1)克隆形成實驗：轉(zhuǎn)染miR-34a、NC、anti-miR-NC和anti-miR-34a的A549細胞各5×103接種于6孔板中，培養(yǎng)72 h后，形成的克隆用甲醇固定，并用含0.1%結(jié)晶紫的20%甲醇染色30 min，計數(shù)形成的克隆數(shù)。(2)傷口愈合實驗：通過傷口愈合實驗方法檢測miR-34a對A549細胞遷移能力，詳細步驟參見文獻報道〔7〕。(3)生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-34a靶基因：通過Target Scans靶基因預(yù)測軟件篩選出Bcl-2作為miR-34a的靶基因。(4)熒光素酶報告基因驗證靶基因：嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS15.0軟件行ANOVA分析和t檢驗。

2結(jié)果

2.1miR-34a在肺癌組織和細胞系的表達miR-34a在肺癌組織的表達量較正常組織相比顯著降低(P<0.05)；且miR-34a在肺癌細胞系A(chǔ)549中的表達量亦顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-34a對A549細胞增殖和遷移的影響轉(zhuǎn)染miR-34a可顯著抑制A549細胞的克隆形成能力(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-34a可顯著增加A549細胞的克隆形成能力(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-34a可顯著抑制A549細胞的遷移能力(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-34a可顯著增加A549細胞的遷移能力(P<0.05)。見圖1。

圖1　miR-34a對A549細胞增殖和遷移能力的影響

2.3miR-34a靶基因預(yù)測TargetScans靶基因預(yù)測軟件提示Bcl-2可能是miR-34a的靶基因，且為感興趣的基因。miR-34a預(yù)測結(jié)合的Bcl-2 3'-UTR靶位點如圖2。共轉(zhuǎn)染野生型pMIR-Bcl-2 3’-UTR載體和miR-34a后，熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染突變型pMIR-Bcl-2 3’-UTR載體和miRNA-34a的熒光素酶活性未出現(xiàn)顯著性改變。

圖2　TargetScans靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miR-34a靶基因

2.4miR-34a與Bcl-2表達相關(guān)性轉(zhuǎn)染miR-34a可顯著抑制A549細胞中Bcl-2的表達(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-34a可顯著增加A549細胞中Bcl-2的表達(P<0.05)。見圖3。

圖3　Western印跡檢測Bcl-2表達

3討論

miRNA是一類小的非編碼RNAs，長度約為19～25個核苷酸。miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行負調(diào)控。miR在許多生物過程，包括發(fā)育、分化、凋亡、代謝、免疫和腫瘤進展中均具有重要的作用。近年來，許多研究表明miR在人類癌癥的進展中具有重要的作用〔8，9〕。在膠質(zhì)瘤中，miR-34a可通過調(diào)控Akt和Wnt信號通路而調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的增殖和生長〔4〕；在骨肉瘤中，miR-34a已證實可通過調(diào)控骨肉瘤細胞的增殖和遷移而參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展〔5〕。本研究提示，miR-34a具有抑制肺癌發(fā)生和發(fā)展的作用。該結(jié)果與文獻報道〔6〕的miR-34a與NSCLC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的結(jié)果一致。然而，關(guān)于miR-34a抑制NSCLC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制目前尚未完全研究清楚。

miRNAs主要通過調(diào)節(jié)下游靶基因而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，因此下游作用的靶基因決定了miRNAs 的作用。Bcl-2基因是一種原癌基因，已知與內(nèi)在凋亡途徑密切相關(guān)〔10〕。Bcl-2蛋白根據(jù)功能不同主要分為抑制凋亡作用和促進凋亡作用〔11〕。此外Bcl-2還證實與腫瘤細胞增殖密切相關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果提示，Bcl-2為miR-34a的功能性靶基因。

綜上所述，miR-34a可通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達情況而抑制NSCLC細胞系A(chǔ)549的增殖和遷移。在NSCLC治療中，miR-34a可作為一種潛在的治療靶點。

4參考文獻

1權(quán)琳，王毅，徐玲，等.非小細胞肺癌患者外周血循環(huán)內(nèi)皮細胞表達的臨床價值探討〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014;34(9)：1228-31.

2Toyooka S,Mitsudomi T,Soh J,etal.Molecular oncology of lung cancer〔J〕.Gen Thorac Cardiovasc Surg,2011;59(8):527-37.

3Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,etal.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004;101(9):2999-3004.

4Rathod SS,Rani SB,Khan M,etal.Tumor suppressive miRNA-34a suppresses cell proliferation and tumor growth of glioma stem cells by targeting Akt and Wnt signaling pathways〔J〕.FEBS Open Bio,2014;4(5):485-95.

5Lv H,Pei J,Liu H,etal.A polymorphism site in the pre-miR-34a coding region reduces miR-34a expression and promotes osteosarcoma cell proliferation and migration〔J〕.Mol Med Rep,2014;10(6):2912-6.

6Shi Y,Liu C,Liu X,etal.The microRNA miR-34a inhibits non-small cell lung cancer(NSCLC) growth and the CD44hi stem-like NSCLC cells〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e90022.

7Xu LF,Wu ZP,Chen Y,etal.MicroRNA-21(miR-21) regulates cellular proliferation,invasion,migration,and apoptosis by targeting PTEN,RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma,Gejiu City,China〔J〕.PLoS One,2014;9(8):e103698.

8Joshi HP,Subramanian IV,Schnettler EK,etal.Dynamin 2 along with microRNA-199a reciprocally regulate hypoxia-inducible factors and ovarian cancer metastasis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2014;111(14):5331-6.

9Xie K,Liu J,Chen J,etal.Methylation associated silencing of microRNA-34b in hepatocellular carcinoma cancer〔J〕.Gene,2014;543(1):101-7.

10Thomas HE,McKenzie MD,Angstetra E,etal.Beta cell apoptosis in diabetes〔J〕.Apoptosis,2009;14(12):1389-404.

11Lupi R,Dotta F,Marselli L,etal.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro-apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that beta-cell death is caspase mediated,partially dependent on ceramide pathway,and Bcl-2 regulated〔J〕.Diabetes,2002;51(5):1437-42.

12李擴，許秋然，劉欣，等.miR-204通過下調(diào)Bcl-2和Sirt1表達抑制肝癌細胞生長〔J〕.細胞與分子免疫學(xué)雜志,2015;31(2):168-72.

〔2015-04-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：劉苗生(1958-)，男，碩士，主任醫(yī)師，副教授，主要從事臨床腫瘤治療研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6446-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.062