王　晶　劉新秀　劉　濤　吳晶晶　瞿　嬌　李品東

(華中科技大學(xué)國(guó)濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科，湖北　武漢　430030)

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EZp基因在結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞化療中的臨床意義及耐藥作用

王晶劉新秀劉濤吳晶晶瞿嬌李品東

(華中科技大學(xué)國(guó)濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢430030)

〔摘要〕目的探討EZp基因與結(jié)直腸癌各臨床病理參數(shù)、生存期的關(guān)系以及在結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥模型LoVo/5-Fu中的表達(dá)情況。方法采用SP免疫組化技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌中EZp的表達(dá)情況，利用SPSS19.0軟件分析EZp的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床參數(shù)、生存期的關(guān)系；用半定量RT-PCR方法對(duì)EZp基因在耐藥細(xì)胞及其親本細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果EZp表達(dá)與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)；EZp陽性組中位生存時(shí)間為43個(gè)月，陰性組中位時(shí)間>48.74個(gè)月，兩組生存函數(shù)經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=5.86，P=0.015)；EZH2在LoVo/5-Fu與LoVo中的表達(dá)有差異。結(jié)論EZH2基因可能與LoVo/5-Fu細(xì)胞株耐藥機(jī)制有關(guān)，提示EZH2基因表達(dá)可能影響癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性；且EZH2基因?qū)ε袛嘟Y(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制以及病情進(jìn)展有一定臨床價(jià)值。

〔關(guān)鍵詞〕EZH2；結(jié)直腸癌；腫瘤干細(xì)胞；耐藥性

第一作者：王晶(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤研究。

EZp(果蠅E(z)基因的同源基因)是新人類基因，屬PCG(Ploycomb Group)家族基因〔1〕，與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)，通過抑制染色質(zhì)中靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖。EZp蛋白為轉(zhuǎn)錄抑制因子，可抑制多種基因活性如抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，EZp蛋白可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲〔2〕。有相關(guān)報(bào)道表明EZp在多種腫瘤中已有所表達(dá)〔3〕，但關(guān)于結(jié)直腸癌的報(bào)道少見。本實(shí)驗(yàn)擬觀察EZp基因與結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移及病情進(jìn)展的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料56例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，均取自我院2008年3月至2011年3月普外科結(jié)直腸癌手術(shù)的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)腫瘤；②手術(shù)前未予以化療及放療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：非原發(fā)腫瘤、接受化療及放療等治療。男30例，女26例；年齡38～80歲，平均61.32歲。根據(jù)EZp在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，將病例分為陽性和陰性2組進(jìn)行比較。本研究末次隨訪時(shí)間為2014年3月13日，隨訪最長(zhǎng)時(shí)限61個(gè)月。

1.2方法

1.2.1SP免疫組化方法檢測(cè)組織中EZp的表達(dá)所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS液沖洗，EZp采用S-P法免疫組化染色，所用抗體濃度為EZp 1∶300。以PBS溶液代替一抗做空白對(duì)照，以排除假陽性結(jié)果。

1.2.2免疫組化結(jié)果觀察按腫瘤細(xì)胞陽性率分析結(jié)果。在(200、400倍)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取3～4個(gè)高倍視野。因EZp蛋白定位于細(xì)胞核，陽性反應(yīng)為位于細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色顆粒，中等以上染色，且超過10%的腫瘤細(xì)胞有陽性染色者判為陽性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞系的建立結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞在37℃，50 ml/L CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含100 ml/L熱滅活小牛血清，青霉素100 kU/L和鏈霉素100 mg/L的RPMI1640培養(yǎng)液。采用藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)持續(xù)接觸濃度遞增誘導(dǎo)法建立人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞系LoVo/5-Fu，可在含5-Fu 濃度為5.0～6.0 mg/L的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。

1.2.4半定量RT-PCR采用TRIzol一步法提取LoVo和LoVo/5-Fu細(xì)胞的RNA；以1 μg 總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別進(jìn)行不同循環(huán)數(shù)的PCR循環(huán)，以確定最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(26～28個(gè))，并進(jìn)行溫度梯度PCR，以確定各對(duì)引物的最佳退火溫度。β-actin作為內(nèi)參，EZp上游引物：5′-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3′，下游引物：5′-TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA-3′；β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。以β-actin mRNA水平作為內(nèi)參照，每個(gè)PCR產(chǎn)物取10 μl在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用Alpha Innotech的凝膠成像系統(tǒng)(FluorChem IS-9900)，Alpha Ease FC軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗(yàn)。生存曲線的構(gòu)建采用Kaplan-Meier方法，行Log-Rank檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2．1結(jié)直腸癌組織中EZp的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系EZp基因在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的陽性率與病變部位、病理分型、分化程度、腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)，與Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

2.2EZp表達(dá)與生存期的關(guān)系EZp陽性組共33例，其中7例存活，26例死亡。陰性組共23例，其中15例存活，8例死亡。陽性組中位生存時(shí)間為43個(gè)月，陰性組中位時(shí)間>48.74個(gè)月。兩組生存函數(shù)經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.86，P=0.015<0.05)。

2.3EZH2基因驗(yàn)證運(yùn)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)LoVo和LoVo/5-Fu細(xì)胞中EZH2基因在轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞中EZH2mRNA表達(dá)有所上調(diào),見圖1。

表1　結(jié)直腸癌組織中EZp表達(dá)與

圖1　LoVo和LoVo/5-FU細(xì)胞中EZp基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

3討論

近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康〔4，5〕?；蛟谠S多疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用，認(rèn)為可能是疾病致病因素，目前有關(guān)基因治療這一研究方向得到相關(guān)學(xué)者重視〔6〕。APC-B-catenim-Tcf-Myc途徑與結(jié)直腸病變的機(jī)制密切相關(guān)；HNPCC通路，由于多種基因搭配錯(cuò)誤及其他因素引起微病灶不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤無限制生長(zhǎng)；在結(jié)直腸癌細(xì)胞中能觀察到基因過度甲基化引起的雌激素失活，但對(duì)于此途徑目前探究較少。EZp是有關(guān)學(xué)者采用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)與原癌基因Vav蛋白產(chǎn)物相互作用過程中發(fā)現(xiàn)的人類新基因〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織C、D期EZHZ陽性率高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，原因可能為由p組蛋白27位賴氨酸甲基化作用于EZp上調(diào)時(shí)，可使抑制癌細(xì)胞的基因保持沉默，又因位于pRB-E2F通路下游區(qū)的EZp去磷酸化作用，pBb結(jié)合E2F抑制S期基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)，經(jīng)過一系列作用最終促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖，且EZp表達(dá)上調(diào)可抑制某些腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因，臨床表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤發(fā)生與侵襲效果〔7〕。EZp可促使腫瘤浸潤(rùn)，這與上述EZp作用機(jī)制即通過HNPCC通路有關(guān)，在某種程度上會(huì)使正常結(jié)直腸組織惡化成瘤性組織。腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移，EZp可使抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因保持沉默，臨床效應(yīng)為促使腫瘤轉(zhuǎn)移〔8〕。當(dāng)EZp上調(diào)時(shí)，EZp可使絕大部分抑癌基因沉默〔9〕。同時(shí)，EZp表達(dá)增高與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后差相關(guān)，推測(cè)其可能成為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)記物。

綜上所述，EZp基因可能與LoVo/5-Fu細(xì)胞株耐藥機(jī)制有關(guān)，臨床表現(xiàn)耐藥細(xì)胞LoVo/5-Fu的EZp mRNA表達(dá)上調(diào)。提示EZp基因表達(dá)可能影響癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性；可通過EZp基因?qū)Y(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及病情進(jìn)展進(jìn)行判斷。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-09-17修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：李品東(1981-)，男，博士，主要從事腫瘤研究。

〔中圖分類號(hào)〕R735

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6436-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.058