張旭東　崔大勇　王　新　郭云寶　魯質(zhì)成　張　博

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林　長春　130021)

?

三氧化二砷誘導人腦SHG-44膠質(zhì)瘤細胞凋亡

張旭東崔大勇王新1郭云寶1魯質(zhì)成1張博1

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的觀察三氧化二砷(As2O3)對SHG-44膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制的分子機制。方法在加入SHG-44膠質(zhì)瘤細胞As2O348 h后，采用四甲基偶氮唑藍比色(MTT)方法檢測細胞增殖抑制率；RT-PCR及蛋白免疫印跡(WB)方法，檢測BAX及Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果As2O3對SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強；BAX mRNA及蛋白表達水平與對照組比無明顯變化(P<0.05)，BAX mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)。結(jié)論As2O3通過促進細胞凋亡而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的增殖。

〔關(guān)鍵詞〕三氧化二砷;膠質(zhì)瘤；細胞凋亡

1吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)血管病外科

第一作者：張旭東(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)血管病的研究。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其發(fā)病率高，生長速度快〔1〕。目前，臨床上在進行膠質(zhì)瘤治療時常采用手術(shù)切除為主，放、化療為輔的治療方法。但是，患者在治療后，1年的生存率低于50%，而兩年的生存率更是不及10%。目前研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)不僅可以治療血液腫瘤，還可以對其他實體腫瘤有作用，而且關(guān)于As2O3對人腦SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的作用也知之甚少。本研究圍繞As2O3誘導膠質(zhì)瘤(SHG-44)細胞凋亡的機制展開，為As2O3將來用于腦內(nèi)膠質(zhì)瘤的臨床應用提供可靠的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及分組實驗中使用的人腦SHG-44細胞由中科院上海細胞研究所提供。實驗分為對照組、加As2O31 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。

1.2儀器與試劑Trizol、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Taq酶及M-MuLV等購自寶泰克生物試劑公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司，BAX及Bcl-2單克隆抗體及辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(H+L)購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3MTT比色法測定細胞增殖抑制率將SHG-44細胞制成1×105/ml的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。孵育24 h后加入10 μl不同濃度的As2O3，對照組加生理鹽水。孵育48 h后，各孔加入20 μl 濃度為5 g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.4RT-PCR將加入As2O348 h后的SHG-44細胞按說明書提取總RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄及基因片段擴增。引物序列：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'(452 bp)；Bcl-2：5'-AAC ACC AGA ATC AAG TGT TCG-3'，5'-TCA GGT GGA CCA CAG GTG GC-3'(446 bp)；Bax：5'-AGG GTT TCA TCC AGG ATC GAG C-3'，5'-AGG CGG TGA GGA CTC CAG CC-3'(468 bp)。PCR總反應體積為25 μl ,共30個循環(huán)(94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s)，取PCR產(chǎn)物進行電泳，拍照、存盤。

1.5蛋白免疫印跡法(WB)提取各組細胞的總蛋白，Bio-Rad法測定各樣本中總蛋白含量。然后40 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加一抗4℃過夜、洗滌、加入二抗、再洗滌，最后顯色。SHG-44細胞的生長抑制率(IR)=(1-藥物作用組OD值/對照組OD值)×100%。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS11.0軟件，組間比較行t檢驗。

2結(jié)果

2.1不同濃度的As2O3對 SHG-44細胞增殖活性的影響不同濃度的As2O3作用于SHG-44細胞48 h后，根據(jù)測得OD值計算抑瘤率，結(jié)果顯示，As2O3對SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強：1 μmol/L As2O3的IR為(17.63±1.43)%，2 μmol/L時IR為(30.91±2.93)%，4 μmol/L時為(36.77±5.35)%，8 μmol/L時為(50.77±2.81)%。

2.2As2O3對 SHG-44 膠質(zhì)瘤細胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2 mRNA的影響RT-PCR的電泳結(jié)果顯示，分使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44細胞48 h后，Bax mRNA的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細胞相比沒有明顯的變化(P>0.05)；而Bcl-2 mRNA的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1　凝膠電泳檢測SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞Bax、Bcl-2 mRNA表達

圖2　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量

2.3As2O3對SHG-44細胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2蛋白的影響分別使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細胞48 h后，Bax蛋白的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質(zhì)瘤細胞相比沒有明顯的變化(P>0.05)；而Bcl-2蛋白的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質(zhì)瘤細胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見圖3，圖4。

圖3　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達

圖4　SHG-44神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞Bax、Bcl-2蛋白表達OD值

3討論

As2O3作為砒霜的主要組成成分，白色粉末，易升華，無特殊氣味，微溶于水，易溶于堿和酸?！侗静菥V目》就曾記載使用砒霜等含有砷成分的藥物治療哮喘、梅毒等。1999年通過了國家藥品監(jiān)督管理局的審批，臨床上在2000年開始作為治療APL而廣泛應用〔2〕。本研究結(jié)果表明As2O3對SHG-44膠質(zhì)瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。

細胞凋亡指的是由多個有功能聯(lián)系的基因激活后引起的蛋白表達以及調(diào)控等的作用引起細胞程序性的死亡，是所有生命體都具有的一種基本特征。目前研究表明抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax在細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要的作用〔3〕，其機制與影響線粒體的功能結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性〔4～6〕有關(guān)。有報道指出〔7〕，細胞凋亡的發(fā)生在一定程度上取決于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的比例，如Bax/Bcl-2比值高的細胞，比Bax/Bcl-2比值低的細胞更易發(fā)生凋亡，相反不易發(fā)生凋亡。本實驗說明As2O3誘導了細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，As2O3在體外可以通過促進細胞凋亡而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細胞的增殖。

4參考文獻

1王忠誠.神經(jīng)外科學〔M〕.武漢:湖北科學技術(shù)出版社,1998:424-32.

2Kunrath J,Gurzau E,Gurzau A,etal.Blood pressure hyperreactivity:an early cardiovascular risk in normotensive men exposed to low-to-moderate inorganic arsenic in drinking water〔J〕.J Hypertens,2013;31(2):361-9.

3Hu RG,Lim J,Donaldson PJ,etal.Characterization of the cystine/glutamate transporter in the outer plexiform layer of the vertebrate retina〔J〕.Eur J Neurosci,2008;28(8):1491-502.

4Pacitti D,Wang T,Page MM,etal.Characterization of cytosolic glutathione peroxidase and phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their modulation by in vitro selenium exposure〔J〕.Aquat Toxicol,2013;130-1:97-111.

5Yildiz D,Cakir Y.Efflux of glutathione and glutathione complexes from human erythrocytes in response to inorganic arsenic exposure〔J〕.Biol Trace Elem Res,2012;150(1-3):451-9.

6Dang TN,Arseneault M,Ramassamy C.Regulation of redox-sensitive signaling pathways in rat primary astrocytes following acrolein exposure〔J〕.J Alzheimers Dis,2011;25(2):263-77.

7Maubach G,Sokolova O,Wolfien M,etal.Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ contributes to inhibitor of nuclear factor-kappa B kinase complex activation in Helicobacter pylori infection〔J〕.Int J Cancer,2013;133(6):1507-12.

〔2015-03-21修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：張博 (1981-),男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)血管病的研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6358-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.018