侯改霞　趙功炎　習(xí)雪峰　肖國(guó)強(qiáng)

(河南大學(xué)體育學(xué)院，河南　開(kāi)封　475001)

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表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈Ⅰ、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白表達(dá)的影響

侯改霞趙功炎習(xí)雪峰肖國(guó)強(qiáng)1

(河南大學(xué)體育學(xué)院，河南開(kāi)封475001)

〔摘要〕目的探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈Ⅰ、Ⅳ型膠原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響及可能機(jī)制。方法通過(guò)高脂喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。雄性SD大鼠分為正常對(duì)照組8只，模型組、EGCG低、中、高劑量組，每組10只。EGCG給藥組大鼠每周灌胃7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)大鼠血液血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)和主動(dòng)脈超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN水平的變化。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型組的血液GLU、GHb、GSP水平和主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平及主動(dòng)脈Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，EGCG中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平和主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平及主動(dòng)脈Col Ⅰ表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，EGCG高劑量組主動(dòng)脈Col Ⅳ、FN表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論EGCG對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈膠原合成異常增加具有明顯的改善作用，機(jī)制可能與EGCG的降血糖、抗氧化及降低氧化應(yīng)激下游與膠原代謝相關(guān)的信號(hào)通路效應(yīng)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕2型糖尿病；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；主動(dòng)脈；膠原代謝

1華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院

第一作者：侯改霞(1978-)，女，副教授，博士，主要從事運(yùn)動(dòng)、藥物與慢性病防治研究。

糖尿病大血管病變的特點(diǎn)是血管平滑肌細(xì)胞和膠原纖維隨著病程進(jìn)行性增加，血管壁膠原纖維增加可導(dǎo)致血管硬度增加，表現(xiàn)為血管收縮、舒張功能障礙〔1〕，是導(dǎo)致糖尿病心血管疾病致死致殘的重要原因之一。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是兒茶素中研究最多的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、防輻射和調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生物學(xué)活性，對(duì)肥胖、糖尿病、癌癥、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病具有改善作用。已有研究表明EGCG可以降低糖尿病大鼠腎臟膠原異常增生，可有效改善糖尿病大鼠腎臟纖維化〔2〕。但EGCG對(duì)糖尿病動(dòng)物主動(dòng)脈膠原代謝影響的研究卻很少見(jiàn)。本文分析EGCG對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈Ⅰ、Ⅳ型膠原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)代謝的影響及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物造模與分組雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分成：正常對(duì)照組(8只)和高脂飲食組(43只)，正常對(duì)照組繼續(xù)飼喂普通飼料，高脂飲食組改為高脂飼料喂養(yǎng)。飼喂6 w后，高脂飲食組大鼠過(guò)夜空腹12 h，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)。注射72 h后檢測(cè)大鼠隨機(jī)血糖濃度，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠暫時(shí)成模標(biāo)準(zhǔn)。剔除血糖不達(dá)標(biāo)大鼠。1 w后復(fù)查暫時(shí)成模大鼠，隨機(jī)血糖仍≥16.7 mmol/L為建模成功，剔除不達(dá)標(biāo)大鼠。共有40只大鼠造模成功。將造模成功后大鼠分為模型組、EGCG低、中、高劑量組，每組10只。

1.2主要試劑STZ購(gòu)自Sigma公司，Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN一抗、二抗和DAB顯色試劑購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司，血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.3EGCG灌胃處理EGCG溶于雙蒸水中制成(12 mg/ml)懸濁液。EGCG低(25 mg·kg-1·d-1)、中(50 mg·kg-1·d-1)、高(100 mg·kg-1·d-1)劑量組大鼠分別采用灌胃給藥方式，給藥組大鼠每周灌胃7 d，其他組大鼠灌胃雙蒸水，共12 w。

1.4動(dòng)物取材和指標(biāo)檢測(cè)給藥第12周末，各組大鼠過(guò)夜禁食12 h后，將大鼠稱(chēng)重后腹腔麻醉，剖腹，從腹主動(dòng)脈取血，一部分全血用于GHb檢測(cè)，其余全血3 000 r/min離心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存檢測(cè)GLU、GSP。取胸主動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定以備免疫組化檢測(cè)，另取腹主動(dòng)脈置于 -80℃冰箱保存以做MDA、SOD含量檢測(cè)。

1.4.1血液GLU、GHb、GSP水平檢測(cè)GLU測(cè)試采用磷鉬酸法，GHb采用比色法，GSP采用果糖胺法。操作檢測(cè)流程嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2主動(dòng)脈MDA含量和SOD活性檢測(cè)MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用分光光度法，操作檢測(cè)流程嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3主動(dòng)脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN免疫組化檢測(cè)常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm，SABC法免疫組化染色，DAB顯色，中性樹(shù)脂封片。陽(yáng)性部位顯色為棕黃色，每張切片隨機(jī)選出5個(gè)視野，在400倍光鏡視野下獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，得出每個(gè)視野的平均光密度值(IOD/area)。

2結(jié)果

2.1EGCG對(duì)糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP的影響與正常對(duì)照組相比，模型組、EGCG低、中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平均顯著升高(P<0.01)；EGCG中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平均顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2EGCG對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈MDA含量和SOD活性的影響與正常對(duì)照組相比，模型組、EGCG低、中、高劑量組主動(dòng)脈MDA含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；EGCG中、高劑量組主動(dòng)脈MDA含量均顯著低于模型組(P<0.05)，SOD活性顯著高于模型組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3EGCG對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組主動(dòng)脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；EGCG中、高劑量組主動(dòng)脈Col Ⅰ表達(dá)雖顯著低于模型組(P<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.05)；EGCG高劑量組主動(dòng)脈Col Ⅳ、FN表達(dá)均顯著低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表1　EGCG對(duì)糖尿病大鼠血液GLU、GHb和

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

表2　EGCG對(duì)糖尿病大鼠主動(dòng)脈MDA含量、SOD活性、Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

圖1　EGCG對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達(dá)的影響(DAB，×400)

3討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠空腹GLU、GHb和GSP均明顯升高。GHb是血液中血紅蛋白與糖類(lèi)經(jīng)過(guò)緩慢、連續(xù)的非酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物，合成速率與紅細(xì)胞所處環(huán)境中的糖濃度成正比，GHb能反映測(cè)定點(diǎn)之前1～2個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的平均血糖水平。GSP是一類(lèi)類(lèi)似果糖胺的物質(zhì)，是血漿中蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過(guò)程中形成的一種高分子酮胺結(jié)構(gòu)，其濃度與血糖水平呈正相關(guān)，并保持相對(duì)穩(wěn)定，GSP反映的是測(cè)定前1～3 w內(nèi)血糖的平均水平。因此GHb和GSP分別從長(zhǎng)期和短期反映了機(jī)體血糖濃度變化，是臨床糖尿病病人診斷和評(píng)估血糖水平的良好指標(biāo)〔3〕。EGCG可顯著降低2型糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP水平，且以EGCG高劑量組的效果最好，提示EGCG可長(zhǎng)期穩(wěn)定的改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂的現(xiàn)象，可能機(jī)制：① α-葡萄糖苷酶是小腸內(nèi)單糖吸收入血的關(guān)鍵酶。EGCG具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用，可降低餐后血糖的持續(xù)升高，發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)作用〔4〕。② EGCG是胰島素敏感因子〔5〕，可增加胰島素敏感性〔6～8〕，改善胰島素抵抗和糖代謝障礙，增加體內(nèi)葡萄糖的吸收和代謝。③ EGCG通過(guò)其高效的抗氧化活性，有效地清除自由基，改善體內(nèi)血糖升高引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激對(duì)胰腺β細(xì)胞的損傷，從而避免了胰島素分泌功能障礙而導(dǎo)致的血糖進(jìn)一步升高〔9，10〕。④ 糖異生增強(qiáng)是糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因之一。葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖異生過(guò)度活化的關(guān)鍵酶，肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)是PEPCK和G6Pase關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，EGCG可通過(guò)下調(diào)肝臟〔11〕、腸道〔12〕HNF4α的表達(dá)而降低PEPCK和G6Pase的表達(dá)，抑制肝臟和腸道糖異生作用的過(guò)度活化。

葡萄糖自氧化、線粒體產(chǎn)生的活性氧(ROS)、非酶糖基化和多元醇通路是糖尿病機(jī)體內(nèi)ROS的主要來(lái)源。同時(shí)高血糖還可使糖尿病機(jī)體組織內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶基因表達(dá)下調(diào)，ROS清除減少〔13〕。動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平上升可導(dǎo)致胰島素抵抗、抑制胰島素分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步升高機(jī)體血糖水平，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因之一〔14，15〕。

本實(shí)驗(yàn)表明，2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平顯著升高，而EGCG中劑量組和高劑量組對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平均有降低作用，尤其以EGCG高劑量組的效果最好，這可能與EGCG的降血糖作用有密切關(guān)系。但EGCG對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平降低作用的另一個(gè)重要原因是EGCG的強(qiáng)抗氧化作用。EGCG分子結(jié)構(gòu)上的B環(huán)和D環(huán)上具有多個(gè)抗氧化作用的酚羥基結(jié)構(gòu)，因此具有很強(qiáng)的抗氧化作用〔16〕。但EGCG抗氧化作用的詳細(xì)機(jī)制尚不完全明確，推測(cè)與其清除自由基〔17〕、提高抗氧化酶活性〔18，19〕的作用有關(guān)。

糖尿病大血管病變是糖尿病患者心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。由糖尿病所引起的血管壁膠原含量的增加與血管收縮、舒張功能障礙密切相關(guān)。

Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN是主動(dòng)脈壁細(xì)胞外間質(zhì)成分(ECM)的重要組成部分。本研究結(jié)果提示2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈壁膠原合成異常增加，而EGCG中劑量組和高劑量組對(duì)2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈膠原合成異常增加均具有改善作用，尤其以EGCG高劑量組的效果最好。分析原因可能與EGCG有效降低2型糖尿病大鼠血糖和主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平有關(guān)。機(jī)體在高血糖狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生增多，激活多條與ECM合成有關(guān)的信號(hào)通路，直接或間接促進(jìn)致纖維化因子TGF-β1蛋白表達(dá)，促進(jìn)ECM成分的合成〔20，21〕。2型糖尿病大鼠血糖和主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平的下降，主動(dòng)脈壁膠原合成異常增加得到顯著改善；ECM的降解主要與纖維蛋白溶酶原激活劑(PA)/PA抑制劑(PAI)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)/MMP抑制劑(TIMP)系統(tǒng)有關(guān)。有研究表明高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平增加可打亂糖尿病機(jī)體PA/PAI和MMP/TIMP的表達(dá)之間的協(xié)調(diào)關(guān)系，致使ECM降解減少〔22，23〕。2型糖尿病大鼠血糖和主動(dòng)脈氧化應(yīng)激水平的下降，主動(dòng)脈壁膠原降解能力得到顯著改善。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：習(xí)雪峰(1978-)，男，博士，講師，主要從事運(yùn)動(dòng)、藥物與慢性病防治研究。

基金項(xiàng)目：河南省科技廳2011年科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.112102310576)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R587

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6330-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.005