武　冰　吳智春　季旭明　劉國偉　劉　恒　于華蕓

(山東中醫(yī)藥大學，山東　濟南　250355)

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加味孔圣枕中丹對局灶性腦缺血模型大鼠神經細胞凋亡的影響

武冰吳智春季旭明劉國偉劉恒1于華蕓

(山東中醫(yī)藥大學，山東濟南250355)

〔摘要〕目的研究加味孔圣枕中丹對局灶性腦缺血模型大鼠神經細胞凋亡及凋亡相關蛋白Bcl-2、P53表達的影響。方法線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，隨機分為模型組、銀杏葉組及加味孔圣枕中丹組，另設假手術組(n=10)。灌胃給藥，連續(xù)14 d。觀察大鼠神經功能癥狀評分，熒光TUNEL法檢測神經細胞凋亡，免疫組織化學法測定Bcl-2、P53表達。結果與模型組比較，加味孔圣枕中丹能顯著降低局灶性腦缺血大鼠Zea Longa 和網(wǎng)屏實驗評分，降低神經細胞凋亡率和P53蛋白表達，增強Bcl-2蛋白表達(P均<0.05)。結論加味孔圣枕中丹能改善腦缺血引起的神經功能損傷，其機制可能與調控凋亡相關蛋白表達、抑制腦缺血引起的神經細胞凋亡相關。

〔關鍵詞〕加味孔圣枕中丹；局灶性腦缺血；細胞凋亡；Bcl-2；P53

1山東大學齊魯醫(yī)院耳鼻喉實驗室

第一作者：武冰(1991-)，女，在讀碩士,主要從事中藥資源與質量控制研究。

神經細胞凋亡是腦缺血疾病造成神經系統(tǒng)損傷的重要病理生理機制，通過相應措施延緩或抑制神經細胞凋亡，對于改善、恢復患者神經功能有積極作用。加味孔圣枕中丹可補腎活血開竅，具有改善腦缺血后神經功能損傷的作用〔1〕。本次研究采用局灶性腦缺血模型大鼠，通過觀察加味孔圣枕中丹對腦缺血大鼠神經細胞凋亡的干預作用，探討其改善神經功能損傷的可能機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物清潔級SD雄性大鼠，240～280 g，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(魯)20050015。

1.1.2實驗藥物加味孔圣枕中丹組成有龜板、石菖蒲、生龍骨、山茱萸、肉蓯蓉、丹參、遠志、川芎，飲片均購自山東省宏濟堂大藥店，水煎濃縮制成200%濃度(含生藥2 g/ml)；華納杏銀杏葉分散片(批號：100603)，湖南華納大藥廠有限公司，實驗前配制成混懸液，濃度為2.2 g/100 ml。4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3實驗試劑和儀器Bcl-2、P53單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；TUNEL試劑盒(美國ROCHEI公司)；LEICARASP300全自動脫水機(德國)；LEICARM2145自動切片機(德國)；奧林巴斯IX71熒光倒置顯微鏡(日本)。

1.2實驗方法

1.2.1模型復制采用Longa等〔2〕報道的大腦中動脈栓塞 (MCAO)法建立局灶性腦缺血大鼠模型。模型成功判定標準：左側肢體疼痛回縮遲鈍或消失；提尾倒懸時左上肢向胸前屈曲；行走時左側傾倒或向左轉圈；右側出現(xiàn)霍納征，如霍納征不出現(xiàn)則應有左側肢體癱瘓體征。假手術組除插線1 cm外，其余步驟同造模組 。

1.2.2動物分組及給藥30只MCAO大鼠隨機分為模型組、銀杏葉組和加味孔圣枕中丹組，另設假手術組，每組10只。造模成功24 h后分別予以銀杏葉片混懸液和加味孔圣枕中丹水煎濃縮液(18 ml/kg體質量)灌胃，假手術組及模型組大鼠灌胃等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。實驗大鼠未到觀察時相點死亡者，通過隨機抽樣原則補齊。

1.2.3動物神經行為學評價模型制作成功后分別在術后24 h、給藥7 d和給藥14 d進行神經功能評分，采用Zea Longa和網(wǎng)屏實驗評分法〔2,3〕。

1.2.4熒光TUNEL法檢測神經細胞凋亡組織切片常規(guī)脫蠟、水合，加蛋白酶K(20 μg/ml)，37℃孵育30 min，與含末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和TMR結合的脫氧尿苷三磷酸(TMR-dUTP)反應液在37℃下孵育60 min，PBS液洗3次。實驗的陰性對照用去離子水代替TdT液。細胞核用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)復染。熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈藍色熒光，凋亡細胞呈紅色熒光。每例觀察5個視野(×400)，計算細胞凋亡率(AR)。AR(%)=(TUNEL染色陽性細胞數(shù)/神經細胞總數(shù))×100%。

1.2.5免疫組織化學法檢測Bcl-2、P53蛋白表達組織切片常規(guī)脫蠟、抗原修復，按照試劑盒說明書操作，應用SABC法。200倍鏡下，隨機選取3個視野，Image Pro Plus醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，計算積分光密度(IOD)。

1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS14.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠神經行為學比較與假手術組比較，模型組大鼠Zea Longa評分和網(wǎng)屏實驗評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加味孔圣枕中丹組大鼠Zea Longa評分和網(wǎng)屏實驗評分顯著降低(P<0.05)，見表1，表2。

2.2對神經細胞凋亡的影響TUNEL結果顯示，假手術組神經細胞凋亡率為(18.46±1.96)%，模型組為(42.18±1.87)%，銀杏葉組為(38.88±1.13)%，加味孔圣枕中丹組為(26.10±1.54)%。與假手術組比較，模型組神經細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉組、加味孔圣枕中丹組大鼠神經細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.3對凋亡相關蛋白Bcl-2和P53表達的影響免疫組化結果顯示，Bcl-2陽性細胞可見棕黃色或棕褐色顆粒，陽性表達定位于神經細胞胞質、核膜及突起。Bcl-2蛋白各組陽性表達IOD值分別為假手術組(3 825.42±1 190.22)，模型組(2 793.89±326.41)，銀杏葉組(3 554.68±807.70)，加味孔圣枕中丹組(3 677.07±762.96)。P53陽性表達定位在細胞核或細胞質，陽性細胞可見棕黃色或棕褐色顆粒。P53蛋白各組陽性表達IOD值分別為假手術組(2 189.78±578.13)，模型組(2 844.45±851.44)，銀杏葉組(2 513.22±437.73)，加味孔圣枕中丹組(2 263.41±579.38)。與假手術組比較，模型組大鼠Bcl-2蛋白表達明顯降低，P53蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉組大鼠Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，加味孔圣中丹組大鼠Bcl-2蛋白表達顯著升高，P53蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖2，圖3。

表1　大鼠Zea Longa評分結果

與假手術組比較:1)P<0.05；與模型組比較2)P<0.05

表2　大鼠網(wǎng)屏實驗評分結果

與假手術組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；與銀杏葉組比較:3)P<0.05

圖1　神經細胞凋亡(熒光TUNEL，×400)

圖2　各組Bcl-2蛋白表達(SABC,×200)

圖3　各組P53蛋白表達 (SABC,×200)

3討論

80%左右的腦卒中屬于缺血性腦卒中〔4,5〕。腦缺血后半暗區(qū)神經細胞處于低氧、低灌注狀態(tài)，發(fā)生以細胞凋亡為主的遲發(fā)性死亡，是缺血后神經功能損傷的重要原因之一。保護神經細胞，抑制其凋亡可減少缺血后神經功能損傷，是防治腦缺血損傷的重要干預靶點。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主性死亡過程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的協(xié)同調控。bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的抑凋亡基因，編碼Bcl-2家族蛋白質。Bcl-2蛋白可以在神經系統(tǒng)內表達，參與磷酸化依賴性調節(jié)，線粒體介導的細胞內凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達與細胞存活密切相關，增加腦內Bcl-2的表達可減少腦梗塞灶大小，減少神經細胞的凋亡，引起特定腦區(qū)神經細胞數(shù)目的增多〔6，7〕。p53基因是促進細胞凋亡的重要基因，編碼P53蛋白。P53蛋白可防止細胞增生和保持DNA受損基因組的完整性，以細胞凋亡的方式清除異常細胞，在多種腦缺血動物模型中P53表達上調〔8,9〕。

缺血性腦血管病屬中醫(yī)學“中風”范疇，腎精虧虛，瘀血阻竅是其主要病機〔10,11〕?！澳X為髓之海”，賴髓之充養(yǎng)，腦髓為腎之精華所化生。缺血性腦血管病多發(fā)于中老年人，中年之后腎精漸虧，不能生髓充腦，髓?？仗?，則腦的生理功能得不到正常發(fā)揮，此為病本。腎精不足，陰血虧虛，脈道失養(yǎng)，血行澀滯可留瘀；加之老年人喜靜好臥，過于安逸，亦可使氣血運行緩慢，甚則停而為瘀，腦絡中血液凝澀不暢，則發(fā)為中風?？梢姳静∫阅I虛為本，瘀血阻竅為標。治當以補腎活血開竅以標本兼顧。篩選《備急千金要方》孔圣枕中丹加味，方中龜板、山茱萸、肉蓯蓉滋腎陰、溫腎陽，治腎精虧虛之本；川芎、丹參活血祛瘀，石菖蒲、遠志、龍骨開竅醒神，五藥活血開竅以治病標。方中補陰藥與補陽藥配伍，以陰陽并補；補腎與活血開竅藥同用，以標本兼顧，尤為適宜于缺血性腦中風辨證為腎虛瘀阻竅閉者。 本次研究發(fā)現(xiàn)加味孔圣枕中丹能明顯改善局灶性腦缺血引起的大鼠神經功能缺損，其作用機制可能與抑制神經細胞凋亡、上調大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達、下調P53蛋白表達相關。

4參考文獻

1于華蕓,吳智春,趙艷,等.加味孔圣枕中丹對局灶性腦缺血大鼠神經行為學及VEGF表達的影響〔J〕.世界中西醫(yī)結合雜志,2013；8(12):1211-4.

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9Yonekura I,Takai K,Asai A,etal.p53 potentiates hippocampal neuronal death caused by global ischemia〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2006；26(10):1332-40.

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11嚴一文.試論腦病(中風)從腎論治〔J〕.中國中醫(yī)急癥,2011；20(9):1450-4.

〔2014-11-17修回〕

(編輯李相軍)

Impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis of neural cells in MCAO rats

WU Bing,WU Zhi-Chun,JI Xu-Ming,etal.

Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo study the impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis,Bcl-2 and P53 expressions of neural cells in focal cerebral ischemia rats.MethodsThe model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by suture method.30 MCAO rats were randomly divided into model,ginkgo leaf and modified Kongsheng Zhenzhong pills groups.The neurological symptom scores were observed for the analysis of neural behavior.Fluorescent TUNEL assay was used to detect neural cells apoptosis.Immunohistochemistry was employed to determine the expressions of apoptosis-related protein Bcl-2 and P53.ResultsCompared with those of model group,the scores of Zea Longa and screen test,the apoptosis rate of neural cells and the expression of P53 were reduced,while the expression of Bcl-2 was increased significantly in modified Kongsheng Zhenzhong pills group(P<0.05).ConclusionsModified Kongsheng Zhenzhong pills could improve the nerve function injury of MCAO rats by modulating the expression of apoptosis-related protein and inhibiting the neuronal apoptosis.

【Key words】Modified Kongsheng Zhenzhong pills;Focal cerebral ischemia;Apoptosis;Bcl-2;P53

通訊作者：于華蕓(1977-)，女，博士，碩士生導師，副教授，主要從事復方藥理學研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(81202641)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2009-006)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6325-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.003