趙　佳　李向楠　朱登彥　吳　愷　丁　政　盛銀良　喬呈瑞　楊　洋　劉東雷　趙　松

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南　鄭州　450052)

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拓撲替康對食管癌EC9706細胞自噬和凋亡的影響

趙佳李向楠朱登彥吳愷丁政盛銀良喬呈瑞楊洋劉東雷趙松

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南鄭州450052)

摘要〔〕目的探討拓撲替康(TPT)對食管鱗癌細胞株(EC9706)自噬和凋亡的影響。方法使用20 mg/L TPT和(或)5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理人食管鱗癌細胞EC9706，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測TPT對食管癌EC9706細胞生長的抑制作用，單丹磺酰尸胺(MDC)法檢測TPT對EC9706細胞自噬水平的影響，采用流式細胞儀技術(shù)檢測TPT對EC9706細胞凋亡的影響，Western 印跡測定TPT對EC9706細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達的影響。結(jié)果流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，TPT作用于EC9706細胞48 h后，TPT組、3-MA組及TPT+3-MA組細胞凋亡結(jié)率分別為(32.45±2.79)%、(7.58±1.12)%及(48.69±3.51)%。MDC染色結(jié)果顯示TPT能夠誘導細胞內(nèi)自噬囊泡的出現(xiàn)，而3-MA能顯著抑制這一現(xiàn)象。Western 印跡結(jié)果顯示對照組、TPT組、3-MA組及TPT+3-MA組Beclin1和Caspase-3蛋白的相對灰度值分別為0.62±0.06、0.91±0.12、0.47±0.04、1.04±0.08和0.54±0.05、0.84±0.11、0.42±0.03、0.71±0.07。結(jié)論TPT康可以誘導食管鱗癌細胞自噬和凋亡的發(fā)生，而3-MA能夠通過抑制自噬上調(diào)Caspase-3的表達增強對食管癌細胞的殺傷作用。

關(guān)鍵詞〔〕拓撲替康；食管癌；凋亡；自噬

第一作者：趙佳(1982-)，男，主治醫(yī)師，主要從事胸外科基礎(chǔ)與臨床研究。

拓撲替康(TPT)屬于喜樹堿類化合物，主要通過抑制拓撲異構(gòu)酶I的活動，通過抑制DNA復制而起到抗癌的作用〔1〕，現(xiàn)多用于肺癌及晚期卵巢癌的化療。研究表明TPT作為放療增敏劑在肺癌、頭頸部腫瘤及食管癌的治療中有效〔2〕，但其對于食管鱗癌細胞的作用及其機制尚不完全清楚。本研究主要觀察TPT對于體外培養(yǎng)的食管鱗癌細胞株(EC9706)細胞自噬和凋亡的影響，并進一步明確自噬和凋亡在其中所起的作用。

1材料與方法

1.1材料TPT康購自貴州漢方制藥有限公司，人食管鱗癌細胞株EC9706由河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室贈送；3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、單丹磺酰尸胺(MDC)為美國Sigma公司產(chǎn)品。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購自美國Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Beclin1及Caspase-3多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)與分組EC9706細胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～ 3 d換液1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。將細胞分為空白對照組、TPT組(20 mg/L)、3-MA組(5 mmol/L)及聯(lián)合應(yīng)用組TPT(20 mg/L)+3-MA(5 mmol/L)組。

1.3MTT法檢測細胞抑制率取對數(shù)生長期細胞，按每孔1×106/L細胞接種于96孔板，每孔加入100 μl細胞懸液培養(yǎng)24 h；分別加入一系列濃度的3-MA及TPT，每孔加入100 μl，對照組加入等體積培養(yǎng)液，放入37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 μl，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，震蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞生長抑制率=〔1-實驗組A490/對照組A490〕×100%。

1.4AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期細胞，以1×107/L的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后按實驗分組分別加入相應(yīng)濃度藥物， 胰酶消化并離心收集細胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作，先加入AnnexinV-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl PI， 立即上流式細胞儀檢測。每組實驗重復3次。MDC染色檢測細胞自噬水平變化：取對數(shù)生長期細胞，以1×107/L接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后按實驗分組分別加入相應(yīng)濃度的TPT和(或)3-MA，同時設(shè)立陰性對照組，棄培養(yǎng)液，加入濃度為50 μmol/L的MDC在37℃下染色60 min，棄染液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用倒置熒光顯微鏡觀察自噬空泡的變化情況并攝片。

1.5Western 印跡檢測細胞Beclin1和Caspase-3蛋白的表達取對數(shù)生長期細胞，以1×106/孔細胞密度接種，待細胞貼壁后，按相應(yīng)實驗濃度加入相應(yīng)藥物，同時設(shè)立空白對照組。提取各組細胞總蛋白，使用考馬斯亮藍法進行蛋白質(zhì)定量，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉常溫封閉1 h，分別加入Beclin1及Caspase-3抗體，4 ℃孵育過夜,后加入二抗，輕輕振搖2 h后洗二抗，并進行顯影、定影、洗片。后將結(jié)果掃描后進行灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參照。

1.6統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1MTT檢測結(jié)果EC9706細胞的生長抑制率隨著TPT和3-MA濃度的增加而逐漸增加。作用48 h后，TPT的IC50為20 mg/L，3-MA的IC10為5 mmol/L，因此將這兩個濃度作為實驗濃度。

2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡AnnexinV-FITC/PI法檢測結(jié)果顯示，空白對照組、3-MA組、TPT組及TPT+3-MA組細胞凋亡結(jié)率分別為(3.41±0.47)%、(7.58±1.12)%、(32.45±2.79)%、(48.69±3.51)%。與對照組相比，3-MA組明顯高于空白對照組；與TPT組相比，TPT+3-MA組細胞凋亡率明顯高于單用TPT組。

2.3MDC檢測細胞自噬細胞內(nèi)自噬空泡可被染成綠色點狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，3-MA組細胞未見明顯自噬空泡，單用TPT組細胞可見細胞中出現(xiàn)大量自噬空泡。與TPT組相比，3-MA+TPT組綠色熒光強度明顯減少。

2.4Western 印跡檢測細胞Beclin1和Caspase-3的表達與對照組相比，TPT組Caspase-3和Beclin1蛋白表達均明顯增加；與TPT組相比，TPT與3-MA聯(lián)合作用組Caspase-3蛋白明顯增加，Beclin1蛋白表達有所減少，見表1。

表1　各組細胞中Beclin1和Caspase-3表達

與對照組相比:1)P<0.05；與TPT組相比:2)P<0.05

3討論

食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，目前食管癌的治療仍是以手術(shù)、放療和化療為主的聯(lián)合治療。盡管近年來化療在局部晚期的食管癌治療中起到越來越重要的作用，但其效果仍不令人滿意。TPT主要通過抑制拓撲異構(gòu)酶I的活性，使DNA單鏈斷裂進而起到抑制腫瘤細胞生長的作用。已有研究顯示，TPT康能夠在多種人腫瘤細胞中起到放射增敏作用，如肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、食管癌等。本研究結(jié)果顯示，TPT能夠?qū)w外生長的食管鱗癌EC9706細胞起到明顯的殺傷作用，且這一作用呈時間-劑量依賴性。

細胞自噬是細胞內(nèi)一種保守的蛋白降解通路，研究顯示其與細胞生長發(fā)育、分化及死亡關(guān)系密切，并與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)〔3〕。Beclin1是酵母ATG6的同系物，是反映細胞內(nèi)自噬水平高低的標志性分子之一，在細胞內(nèi)自噬溶酶體形成的過程中發(fā)揮重要作用〔4〕。在本研究中，MDC染色結(jié)果顯示TPT能夠在誘導EC9706細胞發(fā)生凋亡的同時亦導致細胞內(nèi)自噬水平的增加，而自噬特異性抑制劑3-MA能夠抑制自噬水平的提高。

為了進一步明確自噬和凋亡在TPT對EC9706細胞抑制過程中的作用，我們將自噬特異性抑制劑3-MA與TPT聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果顯示3-MA能夠增加TPT對EC9706細胞的殺傷作用，MDC染色及Western 印跡結(jié)果提示這一作用可能與3-MA抑制細胞內(nèi)自噬水平有關(guān)。流式細胞儀檢測結(jié)果提示，3-MA與TPT聯(lián)合應(yīng)用后細胞凋亡率明顯升高，Western 印跡結(jié)果顯示其機制可能與Caspase-3蛋白的激活有關(guān)。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成員，大多數(shù)觸發(fā)細胞凋亡的因素最終均需要Caspase-3介導的信號轉(zhuǎn)導通路導致細胞凋亡〔5〕。本研究結(jié)果提示，在TPT誘導食管癌EC9706細胞發(fā)生凋亡的過程中，自噬可能起到保護作用，抑制自噬可能能夠通過激活內(nèi)源性凋亡通路而增加細胞凋亡。

綜上所述，結(jié)合本研究結(jié)果認為TPT能夠?qū)θ薊C9706細胞的生長有明顯的抑制作用，而聯(lián)合自噬抑制劑有可能增加拓TPT的治療效果，這些發(fā)現(xiàn)為下一步TPT的臨床研究提供了實驗依據(jù)。

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5Yamaguchi M.The anti-apoptotic effect of regucalcin is mediated through multisignaling pathways〔J〕.Apoptosis，2013;18(10):1145-53.

〔2015-09-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：趙松(1963-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事胸部腫瘤的基礎(chǔ)及臨床診治研究。

中圖分類號〔〕R735.1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6061-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.024