楊文慧　郭　濤　楊　莉　華寶桐　劉　娟

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院老年病科，云南　昆明　650051)

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大鼠急性心肌梗死模型的建立

楊文慧郭濤1楊莉華寶桐1劉娟2

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院老年病科，云南昆明650051)

摘要〔〕目的探討建立一種能模擬臨床心肌梗死事件及其病理生理變化的動物模型。方法SD大鼠麻醉后，經(jīng)口插管連接小動物呼吸機(jī)，開胸高位結(jié)扎冠狀動脈左前降支。術(shù)后1 w超聲檢測大鼠心功能，TTC染色測量心肌梗死面積，評價模型制作效果。結(jié)果手術(shù)成功率為100%，術(shù)后1 w動物存活率為90.9%。術(shù)后1 w超聲檢查見大鼠LVEDS、LVEDD較術(shù)前擴(kuò)大，LVFS較術(shù)前降低(P<0.05)。大體見缺血區(qū)心室壁變薄塌陷。TTC染色測算梗死面積占左室面積的百分比為 35.80%±4.32%。結(jié)論本文成功建立大鼠心肌梗死模型。該模型成功率高、心肌梗死面積穩(wěn)定，可運(yùn)用于心肌缺血、心力衰竭、心肌重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制和治療方法研究。

關(guān)鍵詞〔〕動物模型；心肌梗死

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科

2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：楊文慧(1982-)，女，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事冠心病、心律失常的基礎(chǔ)及臨床研究。

心肌梗死是冠心病最嚴(yán)重的類型〔1～3〕，深入認(rèn)識其發(fā)病機(jī)制并預(yù)防它的發(fā)生、改善心肌梗死患者的預(yù)后一直是研究的重點(diǎn)。為此，需要建立穩(wěn)定的動物模型來模擬人體發(fā)生心肌梗死的病理生理過程，并在此基礎(chǔ)上開展研究。因模型制作過程中進(jìn)行麻醉、呼吸機(jī)使用、手術(shù)操作以及心肌梗死病變本身的病理特點(diǎn)，導(dǎo)致造模的成功率低、動物術(shù)后存活時間較短、模型平行性差等問題，不利于后續(xù)的研究。本研究采用開胸高位結(jié)扎大鼠左冠前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，旨在為進(jìn)一步的研究提供穩(wěn)定可信的動物模型。

1材料與方法

1.1動物7周齡雄性SD大鼠55只，體重230～290 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供〔SCXK(湘)2013-0004〕。

1.2主要試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國Sigma公司(批號：101060270)；異氟烷：上海雅培制藥有限公司(批號：685632U)；烏拉坦注射液；4%甲醛溶液。

1.3主要儀器小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司制造，ALC-V9型)，心臟超聲儀(GE Vivid E9)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司)；手術(shù)器械若干。

1.4模型制作

1.4.1麻醉及氣管插管術(shù)前禁食、水12 h。9%烏拉坦按照1 ml/100 g劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉〔4〕。注射前回抽針管，以確定沒有刺入血管中。大鼠麻醉后，用皮筋掛住大鼠的門齒及四肢，將大鼠仰臥位固定于180 mm×250 mm自制木板上。手術(shù)燈探照大鼠頸部，用紗布包裹大鼠舌并向外向上牽拉，可清晰觀察到聲門，用18 G 38 mm筆筒型靜脈留置針經(jīng)口插入大鼠氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)。觀察大鼠的呼吸頻率與呼吸機(jī)一致，確認(rèn)氣管插管成功后用膠布固定。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定為：呼吸頻率75次/min，吸呼比1∶1，潮氣量13 cc。

1.4.2冠脈結(jié)扎大鼠胸部去毛，消毒手術(shù)區(qū)域，沿胸骨左緣剪開皮膚，鈍性分離肌肉，剪斷第3、4肋骨，暴露胸腔。用小動物開胸器撐開胸廓，拉出胸腺并固定。小心剪開心包膜暴露心臟，以肺動脈圓錐與左心耳交界處找到左前降支，在左心耳下方1～2 mm處與肺動脈圓錐間用5-0號線縫合〔5〕。進(jìn)針深度1～1.5 mm，約縫合5 mm寬心肌，以保證結(jié)扎住動脈〔6〕。以心尖處變蒼白為結(jié)扎成功標(biāo)志。清除胸腔內(nèi)殘存積血。

1.4.3關(guān)閉胸腔及圍術(shù)期護(hù)理檢查無出血后，用0號線連續(xù)縫合肋骨。關(guān)閉胸腔之前用5 ml針筒連接套管針負(fù)壓吸引胸腔內(nèi)空氣及殘留滲血，同時擠壓胸壁。然后逐層縫合肌肉、皮膚。約5 min后先松開呼吸機(jī)接口，觀察到大鼠自主呼吸恢復(fù)再拔出氣管插管。觀察大鼠呼吸情況，若呼吸道分泌物過多或者有舌后墜應(yīng)及時處理。術(shù)中及術(shù)后麻醉未蘇醒前可用烤燈照射，保持動物體溫，利于術(shù)后恢復(fù)。

1.5模型鑒定

1.5.1心臟功能評價造模后1 w行心臟超聲檢查。異氟烷吸入麻醉大鼠，心前區(qū)備皮，仰臥位固定。心前區(qū)涂抹耦合劑，使用GE Vivid E9彩色超聲儀、9L-D高頻探頭(頻率10.0 MHz)，在二維超聲引導(dǎo)下運(yùn)用M型超聲經(jīng)胸骨旁左室長軸切面，觀察室壁運(yùn)動情況，測量左室收縮末內(nèi)徑(LVEDS)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室短軸縮短率(LVFS)，取3個心動周期的平均值。

1.5.2大體病理造模后1 w處死大鼠，迅速取出心臟，置于預(yù)冷生理鹽水中洗去血液，剔除心房、右心室及筋膜組織。余左心室組織置-20℃冰箱中2 min，取出后沿橫切面將左室心肌均勻切成1 mm薄片。將切片放入37℃預(yù)熱過的1%TTC溶液中，置于水浴恒溫振蕩器中，37℃振蕩染色10～15 min，用4%甲醛液固定24 h，觀察染色結(jié)果。非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色〔7〕。將染色的心肌切片置于生理鹽水中，用直尺設(shè)定好標(biāo)尺后照相，用Imagepro-Plus圖像處理軟件分析測量缺血面積，計(jì)算缺血面積占左心室面積百分比。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1手術(shù)存活率55只大鼠均完成急性心肌梗死模型制作，手術(shù)成功率為100%。其中，1只因麻醉時掙扎，導(dǎo)致趾甲斷裂、甲床出血；1只因咬傷舌頭至舌出血，給予包扎止血后仍于術(shù)后當(dāng)天死亡。另有3只大鼠在手術(shù)第2天死亡，考慮可能與心力衰竭有關(guān)。術(shù)后1 w有50只心肌梗死模型大鼠存活，存活率為90.9%。

2.2超聲心動圖檢查術(shù)后1 w超聲檢查可見左心室前間隔運(yùn)動減弱，左心室擴(kuò)大，左室短軸縮短率降低。見表1。

表1　冠脈結(jié)扎前后超聲檢查大鼠心功能改變±s)

與術(shù)前比較：1)P<0.01

2.3大鼠心肌組織TTC染色造模后1 w處死大鼠取出心臟觀察，大鼠心臟出現(xiàn)左室壁變薄，局部塌陷，表面顏色灰暗。TTC染色后觀察到，非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色。測量計(jì)算梗死面積占左室面積的百分比為 35.80%±4.32%。

3討論

目前，廣泛采用結(jié)扎大鼠冠脈左前降支的方法制作心肌梗死模型。有學(xué)者采用導(dǎo)絲逆行牽拉氣管插管的方法制作20只大鼠心梗模型，手術(shù)成功率95%，1 w存活率為90%〔8〕。另有研究進(jìn)行了10只大鼠心梗模型制作，4 w存活率僅60%〔9〕。本研究術(shù)后1 w存活率均高于上述報道。與以往大鼠心肌梗死模型相比，本文采用靜脈留置針管經(jīng)口插管進(jìn)行機(jī)械通氣，保障手術(shù)安全同時最大限度減小大鼠損傷；采用剪開肋骨方法暴露手術(shù)視野，避免過度擠壓牽拉心臟及大血管，同時使手術(shù)視野清晰易于操作；高位結(jié)扎大鼠冠脈左前降支，使心肌梗死部位及面積相對固定，模型平行性好。

3.1模型動物的選擇當(dāng)通過結(jié)扎等方法使冠狀動脈急性閉塞制造急性心肌梗死的動物模型時，犬類等自身側(cè)支循環(huán)豐富的動物一般不宜選用。這些動物由于自身原有的側(cè)支血管豐富，冠狀動脈急性閉塞后側(cè)支循環(huán)迅速開放，很少形成大面積的心肌梗死，難以達(dá)到研究的要求。豬等大型動物的經(jīng)濟(jì)投入較大，手術(shù)操作的難度大，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高。而小鼠體型較小，需要在顯微鏡下進(jìn)行操作，對術(shù)者的要求較高。相比之下，采用大鼠制備心臟疾病的模型具有較多優(yōu)勢〔10〕。大鼠容易飼養(yǎng)，術(shù)后管理較容易。單人就能模型制作，對實(shí)驗(yàn)儀器要求不高，便于實(shí)驗(yàn)的開展。大鼠的品系比較純正，動物組內(nèi)差異較少，在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有更多的優(yōu)勢。同時，大鼠的冠脈系統(tǒng)側(cè)支循環(huán)比較少，結(jié)扎后容易出現(xiàn)較固定的缺血區(qū)，使心肌梗死的模型制作更加穩(wěn)定。

3.2麻醉方式大鼠麻醉的給藥方式腹腔注射麻醉和吸入麻醉。熟練的術(shù)者完成一例大鼠急性心肌梗死模型的制作約需20 min，期間需保證大鼠絕對安靜。吸入麻醉可控制麻醉深度及復(fù)蘇時間，但需配備有吸入式小動物麻醉機(jī)，實(shí)驗(yàn)成本較高。腹腔注射麻醉維持時間較長，能滿足模型制作的要求。烏拉坦、戊巴比妥鈉、水合氯醛等都是常用的大鼠腹腔麻醉藥物，本實(shí)驗(yàn)采用烏拉坦腹腔注射麻醉取得較好效果。

3.3氣道建立大鼠氣管插管比較常見的是氣管切開插管和經(jīng)口插管。氣管切開插管對大鼠損傷較大，手術(shù)操作時間延長，縫合不當(dāng)可能導(dǎo)致氣管狹窄，也可能出現(xiàn)氣道分泌物和血液堵塞氣道。由于大鼠的聲門較小，術(shù)者不易看清楚聲門的位置，因此本實(shí)驗(yàn)中用紗布包裹后將大鼠舌頭提起，手術(shù)燈照射大鼠頸部，此時可清晰觀察到大鼠聲門。術(shù)者用柔軟的靜脈留置針管進(jìn)行經(jīng)口插管，不易損傷大鼠口咽及氣道黏膜，同時一次成功率高，避免反復(fù)插管引起黏膜水腫導(dǎo)致手術(shù)失敗。

3.4手術(shù)開胸手術(shù)開胸有沿肋間隙進(jìn)胸和切開肋骨進(jìn)胸等方式。文獻(xiàn)報道在第2肋間隙進(jìn)胸獲得滿意的效果〔11〕。但是大鼠心臟體積較小，且心率較快，充分暴露手術(shù)視野方可保證冠脈結(jié)扎的成功率。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們切開第3、4肋骨進(jìn)胸，小動物開胸器擴(kuò)開胸廓，固定胸腺，能充分保證手術(shù)視野清晰，易于術(shù)者操作。術(shù)后仔細(xì)止血，逐層關(guān)胸，并用套管針連接針筒抽吸胸腔內(nèi)殘余氣體，術(shù)后大鼠的恢復(fù)較好。

3.5冠脈結(jié)扎定位大鼠冠脈左前降支由左冠狀動脈主干分出，行于動脈圓錐和左心耳之間，然后向右下行于前室間溝內(nèi)。左冠狀動脈主干和前降支起始端與伴行靜脈的關(guān)系極為密切，高位結(jié)扎很易成功，低位結(jié)扎因動靜脈關(guān)系不恒定，較不易成功〔12〕。本研究在左心耳下方1～2 mm處結(jié)扎左前降支，結(jié)扎后即可觀察到心尖部心肌變?yōu)樯n白色，術(shù)后超聲及病理檢查確認(rèn)模型制作成功，心肌梗死面積穩(wěn)定。大鼠冠狀動脈主干及其主要分支均位于淺層心肌內(nèi)，活體不易辨認(rèn)，而其伴行靜脈為肉眼可見的白色細(xì)小線條，因此，復(fù)制心肌梗死模型結(jié)扎動脈時，以伴行的靜脈為標(biāo)志。

綜上所述，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支復(fù)制的心肌梗死模型與心肌梗死實(shí)際發(fā)病過程比較符合，其梗死分布范圍相對一致，病理生理改變與臨床心肌梗死相似，是目前被廣泛采用的造模方法。按照本實(shí)驗(yàn)操作方法可順利完成多只大鼠急性心肌梗死模型的制備，術(shù)后經(jīng)超聲大體觀察和TTC染色病理觀察確認(rèn)模型制作成功。該方法成功率高、模型穩(wěn)定，可為心臟疾病相關(guān)研究提供可靠的大鼠模型。

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〔2015-05-11修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：郭濤(1957-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病、心律失常的基礎(chǔ)及臨床研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260027)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2014FZ051)

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6019-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.007