劉　軻　李建生　劉敬霞　孫　捷　趙躍武　李　寧　蘇　靜　郭曉燕

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南　鄭州　450006)

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腦脈通對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植保護(hù)腦缺血微血管完整性作用的影響

劉軻李建生1劉敬霞2孫捷1趙躍武3李寧1蘇靜1郭曉燕1

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南鄭州450006)

摘要〔〕目的觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植對(duì)腦缺血再灌注損傷腦微血管完整性的保護(hù)作用以及腦脈通顆粒對(duì)其的影響。方法體外培養(yǎng)和擴(kuò)增BMSCs；大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、移植組、腦脈通組、聯(lián)合組；線栓法制備MCAO模型；術(shù)后24 h將BMSCs由同側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈移植腦內(nèi)；光鏡下觀察BMSCs移植腦內(nèi)7、14和28 d腦微血管病理改變，免疫組化法測(cè)定腦組織IgG和微血管基底膜ColⅣ及LN的表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠IgG表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組比較，腦脈通和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)、移植組14 d和28 d的IgG表達(dá)均顯著減弱(P<0.01)；聯(lián)合組較移植組7 d和28 d、較腦脈通組14 d和28 d的表達(dá)均減弱(P<0.01)。各模型組ColⅣ和LN表達(dá)減弱(P<0.01)；與模型組比較，腦脈通和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)、移植組14 d和28 d的ColⅣ和LN表達(dá)均增(P<0.01)；聯(lián)合組較各移植組、14 d和28 d腦脈通組ColⅣ和LN表達(dá)均較顯著增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論腦缺血再灌注損傷引起微血管基底膜層連蛋白和膠原降解明顯，血腦屏障通透性增強(qiáng)；BMSCs移植后早期(7 d)保護(hù)微血管受損的作用不明顯，中期(14 d)和后期(28 d)用隨移植腦內(nèi)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；腦脈通可使BMSCs移植的保護(hù)作用提前，并使中、后期的作用增強(qiáng)，其途徑可能與減輕微血管基底膜LN和ColⅣ的降解有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕腦缺血；腦脈通；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；微血管完整性

1河南中醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所

2寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院3河南省人民醫(yī)院

第一作者：劉軻(1966-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治缺血性腦血管疾病研究。

腦微血管損傷是引起腦缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制，基底膜主要成分Ⅳ膠原對(duì)維持基底膜的完整性至關(guān)重要，層連蛋白對(duì)基底膜基質(zhì)的組裝起關(guān)鍵作用，保護(hù)腦缺血后的微血管完整性是治療腦梗死的重要途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中非造血實(shí)質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞，具有多向分化潛能，可分化為神經(jīng)、血管內(nèi)皮、肌肉等多種細(xì)胞〔1，2〕。BMSCs移植后可與宿主大腦細(xì)胞整合并長(zhǎng)期存活，并向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。因此，BMSCs移植被認(rèn)為是治療腦缺血理想的新途徑〔3〕。前期研究表明，具有益氣活血、降濁通脈作用的腦脈通顆粒(大黃，川芎，人參，葛根)對(duì)腦缺血神經(jīng)元和微血管損傷具有顯著的保護(hù)作用，腦脈通可使BMSCs移植保護(hù)腦缺血損傷的作用增強(qiáng)〔4，5〕。本實(shí)驗(yàn)擬就腦脈通對(duì)BMSCs移植保護(hù)腦缺血微血管受損的作用進(jìn)行研究，為二者聯(lián)合保護(hù)腦缺血損傷的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料SD大鼠，SPF級(jí)，3～4月齡，190只，雌雄各半，體重(300±50)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：410117號(hào))；培養(yǎng)基D-MEM/F-12(GIBCO Invitrogen Corporation)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)051126)；0.25%胰酶(SIGMA-ALDRICH COMPANY， LTD.批號(hào)05401236)；倒置相差顯微鏡(Olympus optical Co.LTD， JAPAN，型號(hào)PM-10AD)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELDON MANUFACTUREING， INC.MADE IN USA，型號(hào)T02323)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化儀器廠，型號(hào)：5W-CJ-1F)；混纖維濾膜(上海瑞麗分離儀器廠吳涇分廠)；細(xì)胞定量采集管(江蘇通州市平潮鎮(zhèn)求新玻璃儀器廠)；圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus5.1(Media Cybernetics Inc，USA，型號(hào)41N5100-44800)。

兔抗大鼠免疫球蛋白抗體(1∶100，IgG)；兔抗大鼠Ⅳ型膠原抗體(1∶100，type Ⅳ collagen，Ⅳ col)；兔抗大鼠層連蛋白抗體(1∶100，laminin，LN)；羊抗大鼠IgG-生物素；檸檬酸鹽緩沖液；正常山羊血清封閉液；DAB顯色試劑盒。

腦脈通顆粒(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)050407，規(guī)格4 g/袋，每g腦脈通含生藥3.75 g)。

1.2局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蛥⒄崭牧嫉腖onga法線栓阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈制備局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?〕。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸前正中切口，左側(cè)鈍性分離頸總動(dòng)脈(CCA)；分離頸內(nèi)外動(dòng)脈，穿線備用，結(jié)扎翼顎動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈近動(dòng)脈分叉處剪口，栓線穿入頸內(nèi)動(dòng)脈，緩慢推進(jìn)，直至感覺(jué)有阻力為止，穿線成功后留出殘斷，以備拔線進(jìn)行細(xì)胞移植，縫合皮膚，手術(shù)過(guò)程中保持大鼠肛溫37℃，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉鹽，每天40 000 U預(yù)防感染。

1.3BMSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增與移植

1.3.1BMSCs懸液制備將2月齡(平均250 g)的雄性SD大鼠斷頸處死，無(wú)菌條件下取出股骨、脛骨，除去骨表面附著的組織。用D-MEM/F-12培養(yǎng)液(含1萬(wàn)單位肝素)10 ml反復(fù)沖洗骨髓，充分吹打混勻后加入5 ml D-MEM/F-12培養(yǎng)基，重懸，收集骨髓細(xì)胞懸浮液。

1.3.2BMSCs的培養(yǎng)與擴(kuò)增于骨髓細(xì)胞懸浮液中加入含10%FBS胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)液，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，3～4 d換液1次，棄去未貼壁的細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶底時(shí)(>80%)加入0.25%胰酶消化，胎牛血清終止消化，結(jié)束原代培養(yǎng)。

1.3.3BMSCs的重懸、計(jì)數(shù)與移植移植前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心，收集，生理鹽水漂洗3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，重懸，每0.2 ml生理鹽水中細(xì)胞數(shù)為2×106，單細(xì)胞懸液經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈移植入腦。

1.4分組與用藥SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、腦脈通組、BMSCs移植組(簡(jiǎn)稱移植組)、BMSCs移植聯(lián)合腦脈通組(簡(jiǎn)稱聯(lián)合組)，假手術(shù)組10只大鼠，其余4組各45只大鼠又根據(jù)取材時(shí)間不同分為3組，即7、14、28 d組。

術(shù)前4 d腦脈通組和聯(lián)合組分別給予腦脈通顆粒(每天40.5 mg/100 g，40.5 mg/ml)灌胃，假手術(shù)組、模型組和移植組以同等體積的生理鹽水灌胃，每日1次；術(shù)后3 h緩慢拔出栓線進(jìn)行再灌注；再灌注后24 h移植組和聯(lián)合組頸內(nèi)動(dòng)脈給予BMSCs懸浮液200 μl，模型組、腦脈通組頸內(nèi)動(dòng)脈給予和BMSCs同等體積的生理鹽水；移植后腦脈通組和聯(lián)合組大鼠分別給予腦脈通灌胃，模型組和移植組大鼠給予同等體積的生理鹽水灌胃，每周根據(jù)大鼠體重調(diào)整灌胃藥物的用量和灌胃體積〔7〕，每天1次，直至取材。

1.5處理與取材假手術(shù)組大鼠于術(shù)后28 d取材，模型組、移植組、腦脈通組、聯(lián)合組大鼠根據(jù)取材要求的時(shí)間點(diǎn)分別于頸總動(dòng)脈用藥后7、14、28 d麻醉大鼠，用4%的多聚甲醛溶液經(jīng)升主動(dòng)脈進(jìn)行灌注固定，取出全腦，用4℃生理鹽水沖洗3次，除去積血，濾紙吸去表面水分，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去右側(cè)大腦半球，取左側(cè)半球，從額極向后5 mm處冠狀切取腦組織2 mm，置入4%多聚甲醛溶液(pH7.40)，待行HE染色和免疫組化測(cè)定。

1.6指標(biāo)測(cè)定

1.6.1病理觀察常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腦缺血中心區(qū)微血管完整性的變化。

1.6.2內(nèi)源性免疫球蛋白(IgG) 免疫組織化學(xué)觀察石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，3%的過(guò)氧化酶阻斷溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，10%的正常山羊血清封閉液封閉后，滴加兔抗大鼠IgG第一抗體，4℃過(guò)夜以進(jìn)行抗原抗體特異結(jié)合。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(羊抗大鼠IgG-生物素)，室溫下孵育30 min。滴加鏈親和素-過(guò)氧化物酶，室溫下孵育30 min，滴加新鮮配制的DAB溶液，以上各步驟間均經(jīng)PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。IgG表達(dá)在血管周圍的腦組織內(nèi)，光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，陰性呈藍(lán)色；顯微鏡觀察大鼠腦組織缺血側(cè)IgG表達(dá)，隨機(jī)選取缺血側(cè)皮層3個(gè)視野；每組觀察6張切片，合計(jì)18個(gè)視野；圖像分析系統(tǒng)Image-Proplus5.1進(jìn)行圖像采集(顯微鏡20×10倍)；每幅圖像采用盲法進(jìn)行分析測(cè)量，設(shè)定圖像分析系統(tǒng)的最大灰度分級(jí)為(Cmax)256，最大光密度值(Dmax)為2，陽(yáng)性表達(dá)的灰度值與光密度呈反函數(shù)，灰度值的大小與陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，光密度值(即陽(yáng)性表達(dá)的吸光值)大小與細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的強(qiáng)弱呈正相關(guān)；測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)的面積密度(Area)和平均光密度(Density)，計(jì)算整合光密度值(IOD)，計(jì)算公式IOD=Area×Density(mean)；以每視野陽(yáng)性細(xì)胞的整合光密度值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)越多、陽(yáng)性反應(yīng)的吸光值(IOD)越大，表示反應(yīng)越強(qiáng)。

1.6.3腦組織Ⅳ型膠原和層連蛋白(LN)免疫組織化學(xué)染色制片過(guò)程同IgG，將第一抗體改為兔抗大鼠Ⅳ型膠原和LN抗體。Ⅳ型膠原和LN表達(dá)在血管的基底膜，光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，陰性呈藍(lán)色；顯微鏡觀察大鼠腦組織缺血側(cè)Ⅳ型膠原和LN表達(dá)，視野的選取與整合光密度值(IOD)的計(jì)算同IgG。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析，不符合正態(tài)分布者進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后比較。

2結(jié)果

2.1一般情況實(shí)驗(yàn)大鼠動(dòng)脈移植后大鼠死亡出現(xiàn)兩個(gè)高峰，第一次于推液后3～5 d，大鼠毛色欠澤，精神差，多臥少動(dòng)，不能主動(dòng)覓食飲水，體重下降明顯，易出現(xiàn)死亡；第二次于推液后9～11 d，大鼠增長(zhǎng)緩慢，消瘦，分泌物污濁，易再次出現(xiàn)死亡；術(shù)后7 d大鼠體重下降明顯，7～14 d體重漸有增加，14～28 d大鼠全身狀況好轉(zhuǎn)，體重增加明顯。假手術(shù)組、模型組、腦脈通組、移植組、聯(lián)合組各組7、14、28 d合計(jì)死亡動(dòng)物只數(shù)為1、14、11、13、9；大鼠腦組織免疫組化染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片、殘片及背景泛染的標(biāo)本剔除；納入統(tǒng)計(jì)的標(biāo)本數(shù)每組18只，平均每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物為6只。

2.2大鼠腦組織微血管病理變化假手術(shù)組微血管基底膜光滑完整，分布薄厚均勻，血管內(nèi)皮細(xì)胞清晰。模型組大鼠血管壁薄厚不均勻，微血管基底膜欠光滑，部分出現(xiàn)殘缺、破損改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不清晰，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)血管結(jié)構(gòu)破壞、微血管殘缺不連續(xù)程度呈加重趨勢(shì)。腦脈通組7 d的微血管結(jié)構(gòu)改善明顯，其作用隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化；移植組7 d改善微血管受損的作用不明顯，其14 d和28 d的作用顯著；聯(lián)合組大鼠各時(shí)間點(diǎn)微血管破壞減輕，其7、14和28 d微血管的變化程度一致。

2.3大鼠腦組織IgG表達(dá)變化假手術(shù)組神經(jīng)元IgG呈弱陽(yáng)性表達(dá)，模型組大鼠IgG表達(dá)強(qiáng)度均較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)，從7 d到14 d，隨缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)；與模型組比較，腦脈通和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)、移植組14 d和28 d的IgG表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；與移植組比較，聯(lián)合組大鼠7 d和28 d的IgG陽(yáng)性表達(dá)顯著減弱(P<0.01)；聯(lián)合組14 d和28 d的IgG陽(yáng)性表達(dá)均較腦脈通組減弱(P<0.01，P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)組比較，模型組和移植組14 d和28 d的IgG陽(yáng)性表達(dá)均較7 d組減弱，聯(lián)合組28 d的表達(dá)較其7 d和14 d減弱(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠腦組織IgG表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與移植組比較：3)P<0.01；與聯(lián)合組比較：4)P<0.01;同一組內(nèi)與7 d組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與同組內(nèi)14 d組比較：7)P<0.05,下表同

2.4大鼠腦組織ColⅣ表達(dá)變化假手術(shù)組大鼠腦組織ColⅣ呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)，模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠ColⅣ表達(dá)減弱(P<0.01)；與模型組比較，腦脈通和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)、移植組14 d和28 d大鼠腦組織ColⅣ表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.01)；各聯(lián)合組的ColⅣ表達(dá)均較移植組增強(qiáng)(P<0.01)；聯(lián)合組14 d和28 d的表達(dá)較腦脈通組增強(qiáng)(P<0.01)。不同時(shí)間點(diǎn)組比較，模型組、腦脈通組14 d和28 d的ColⅣ表達(dá)均較其7 d減弱，移植組14 d和28 d的表達(dá)增強(qiáng)，聯(lián)合組28 d的表達(dá)較其14 d增強(qiáng)明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.5大鼠腦組織LN表達(dá)變化假手術(shù)組大鼠腦組織LN呈明顯陽(yáng)性表達(dá)，各模型組大鼠LN表達(dá)減弱(P<0.01)；與模型組比較，腦脈通和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)、移植組14 d和28 d的LN表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P<0.01)；各聯(lián)合組均較移植組的LN表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)；聯(lián)合組14 d和28 d的表達(dá)較腦脈通組增強(qiáng)(P<0.01)。模型組、腦脈通組14 d和28 d的LN表達(dá)均較其7 d減弱，移植組14 d和28 d的表達(dá)較其7 d增強(qiáng)，聯(lián)合組28 d的LN表達(dá)較其14 d顯著增強(qiáng)(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表2　各組大鼠腦組織ColⅣ表達(dá)比較

表3　各組大鼠腦組織LN表達(dá)比較值)

3討論

腦缺血再灌注損傷可使毛細(xì)血管基底膜主要成分ColⅣ、LN、纖維黏連蛋白等降解，血腦屏障受損，毛細(xì)血管通透性增加，促使血管源性腦水腫發(fā)生，加重缺血性腦組織損傷〔8〕。腦缺血再灌注損傷與微血管基底膜ColⅣ和LN降解有關(guān)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而加重〔9〕。腦缺血后腦微血管損害是以基底膜破壞為主，基底膜損傷一方面促進(jìn)血栓形成，加重腦缺血；另一方面引起血管通透性增加，加重腦水腫。因此，保護(hù)腦缺血微血管基底膜的完整性具有重要意義。

當(dāng)腦微血管完整性受損，引起血腦屏障通透性增加，IgG等大分子物質(zhì)便可漏出至腦組織中，通過(guò)觀察IgG在腦組織的表達(dá)水平反映血腦屏障的通透性〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)提示血腦屏障的損傷程度隨腦缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)加重趨勢(shì)。

LN、ColⅣ是構(gòu)成基底膜的主要物質(zhì)，大鼠腦缺血再灌注損傷與血腦屏障基底膜成分ColⅣ、LN降解相關(guān)〔9〕。本文表明微血管基底膜的完整性受損程度在早期和中期隨腦缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，其變化趨勢(shì)與前期的研究相似〔12〕，但出現(xiàn)高表達(dá)的時(shí)間較其延后，考慮與腦缺血再灌注時(shí)間的不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦脈通持續(xù)減輕腦缺血再灌注損傷后血腦屏障通透性的作用明顯，該作用可能與減少微血管基底膜LN、ColⅣ的降解有關(guān)。BMSCs能夠合成細(xì)胞外基質(zhì)，以修復(fù)受損的腦微血管〔13～15〕。可以認(rèn)為，BMSCs通過(guò)保護(hù)腦微血管完整性發(fā)揮對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用。本文結(jié)果表明，BMSCs移植后血腦屏障的通透性降低明顯，該作用可能與其減輕微血管基底膜LN、ColⅣ的降解相關(guān)，且隨BMSCs移植腦內(nèi)時(shí)間的延長(zhǎng)，其降低血腦屏障通透性和減輕微血管基底膜損傷的作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)。腦脈通可使BMSCs移植后早期降低血腦屏障通透性的作用提前，并使其后期的作用增強(qiáng)。腦脈通對(duì)BMSCs移植后保護(hù)微血管完整性的作用可能是通過(guò)在腦缺血再灌注損傷早、中、晚三期減輕LN和ColⅣ降解而實(shí)現(xiàn)，其確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-07-20修回〕

(編輯曲莉)

Effect of NaoMaiTong on the protection of the integrity of brain micrangium after BMSCs transplanting in rats with cerebral ischemia

LIU Ke， LI Jian-Sheng， LIU Jing-Xia，etal.

First Affiliated Hospital of Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450006， Henan， China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect on integrity of brain micrangium in rats with cerebral ischemia reperfusion injury after BMSCs transplantation， as well as the role of NaoMaiTong(NMT) in the protection of BMSCs transplantation. MethodsMiddle cerebral artery occlusion (MCAO) model was duplicated with nylon thread. Rats of transplantation and combination groups were transplanted with BMSCs via carotid artery at 24 h after operation. Brain micrangium pathological changes were observed by light microscope， and immunohistochemical method was used to determine the expressions of IgG， ColⅣ and LN. ResultsThe expressions of IgG were increased in rats brain of each model group(P<0.01). Comparing with that of model group， the expression of IgG was decreased in each NMT and combination groups， as well as in 14 d and 28 d transplantation groups(P<0.01). In comparison with those of 7 d and 28 d transplantation groups and 14 d and 28 d NMT groups， IgG expressions were decreased significantly in combination groups. The expressions of ColⅣ and LN were all decreased in each model group. Comparing with those of model groups， the expressions of ColⅣ and LN were increased in each NMT and combination groups， as well as in 14 d and 28 d transplantation groups(P<0.01). In comparison with those of 7 d and 28 d transplantation groups， 14 d and 28 d NMT groups，the ColⅣ and LN expressions were increased significantly in combination groups. ConclusionsNMT could make the effect of BMSCs transplantation ahead of schedule and enhance the protection in metaphase(14 d) and anaphase(28 d)， and the way might be related to soften the degradation of LN in earlier period and ColⅣ in metaphase and anaphase.

【Key words】Cerebral ischemia; Rhubarb Aglycone; BMSCs; Integrity of brain micrangium

通訊作者：李建生(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30973744)

中圖分類號(hào)〔〕R743〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6014-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.005