劉東慧　王小杰　宋成軍　陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北　承德　067000)

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2型糖尿病大鼠肝臟腫瘤壞死因子-α表達(dá)變化及絲膠的保護(hù)作用

劉東慧王小杰1宋成軍陳志宏

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究2型糖尿病大鼠肝臟腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的變化及絲膠的保護(hù)作用。方法雄性SD大鼠48只，隨機分為正常對照組、模型組、絲膠治療組及陽性對照組，每組12只。鏈脲佐菌素連續(xù)腹腔注射法制備2型糖尿病大鼠模型，成功后模型組大鼠不做處理，絲膠治療組大鼠給予2.4 g·kg-1·d-1劑量的絲膠灌胃35 d，陽性對照組大鼠給予55.33 mg·kg-1·d-1劑量的二甲雙胍灌胃35 d。采用SP免疫組化法、蛋白免疫印跡法和RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟TNF-α的表達(dá)情況。 結(jié)果與正常對照組大鼠相比，TNF-α蛋白和mRNA在糖尿病模型組大鼠肝臟中均呈高表達(dá)(P<0.01)；與模型組大鼠相比，TNF-α蛋白和mRNA在絲膠治療組、陽性對照組大鼠肝臟中均呈低表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論絲膠可能通過下調(diào)肝臟TNF-α的表達(dá)改善胰島素抵抗。

關(guān)鍵詞〔〕絲膠；2型糖尿病；肝臟；腫瘤壞死因子-α

1承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所

第一作者：劉東慧(1987-)，女，碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥防治研究。

研究發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、C反應(yīng)蛋白等與胰島素抵抗密切相關(guān)；這些細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)亦與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。其中，TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，以肝臟為重要的靶器官，主要來源于脂肪組織的巨噬細(xì)胞，可在感染、惡性腫瘤、燒傷等狀態(tài)下誘發(fā)機體產(chǎn)生胰島素抵抗〔2〕。本課題組的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，彩色蠶繭水提物絲膠蛋白(簡稱絲膠)能明顯降低2型糖尿病(T2DM)大鼠的血糖，但具體機制尚不清楚。本研究擬探討絲膠是否通過影響肝臟TNF-α的表達(dá)發(fā)揮降血糖的作用。

1材料與方法

1.1實驗用大鼠、藥品和試劑清潔級雄性SD大鼠48只，合格證號712024，體質(zhì)量200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部。絲膠(自制)：由承德醫(yī)學(xué)院桑蠶研究所提供彩色蠶繭，蠶繭浸泡、水煎2次后合并濾液，濃縮至所需濃度。鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司；TNF-α兔抗大鼠多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；二抗(山羊抗兔IgG)，美國KPL公司；藍(lán)色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)，北京泰格美科技有限公司；Trizol，美國Invitrogen公司；TNF-α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒、100 bp DNA Ladder，北京天根生化科技有限公司。

1.2實驗動物分組、模型的建立和給藥48只大鼠隨機分為①正常對照組，12只，大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不做處理。②糖尿病模型組，12只，建立T2DM大鼠模型后不做處理。建立模型的方法：2%STZ(25 mg/kg)每天一次連續(xù)腹腔注射3d，注射STZ后7 d以空腹血糖≥16.7 mmol/L作為模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。③絲膠治療組，12只，按上述方法成功建立T2DM大鼠模型后按2.4 g/kg的劑量給予絲膠灌胃35 d(1次/d)。④陽性對照組，12只，按上述方法成功建立2型糖尿病大鼠模型后按55.33 mg/kg的劑量給予二甲雙胍灌胃35天(1次/d)。

1.3取材和指標(biāo)檢測采用4%水合氯醛腹腔注射的方式麻醉，以毛細(xì)玻璃管插入大鼠內(nèi)眥取血，離心后取上部血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖水平。大鼠取血后處死，取肝臟，一部分入固定液Bouins液中固定，一部分用液氮速凍后放于-80℃冰箱保存。

1.4肝臟TNF-α蛋白表達(dá)的檢測

1.4.1免疫組織化學(xué)染色及定量分析Bouins液固定肝臟常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。采用SP免疫組化法，一抗稀釋濃度為1∶50，陰性對照為PBS代替一抗，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒至棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞標(biāo)志。每組隨機選取12張切片，每張切片在10×40倍顯微鏡下選取肝臟視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對TNF-α陽性產(chǎn)物的IOD值進(jìn)行定量分析。

1.4.2免疫印跡法取30 mg保存的肝臟組織勻漿提取蛋白，蛋白濃度的確定使用二喹林甲酸蛋白定量試劑盒。8%積層膠和12%分離膠電泳，蛋白上樣量100 μg，4℃、2 mA/cm2轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉封閉過夜，TNF-α 1∶100稀釋、β-actin 1∶1 000稀釋一抗室溫孵育2h，二抗(1∶5 000)孵育1 h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。掃描膠片，顯影條帶的分析使用Quantity One 4.6.2軟件，TNF-α蛋白的相對表達(dá)水平以TNF-α目的條帶和β-actin條帶的灰度比值計。

1.5RT-PCR法檢測肝臟TNF-α mRNA的表達(dá)在液氮中將100 mg肝臟碾磨成粉末，加入Trizol后提取肝臟的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳確定所提取總RNA的完整性。以3 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件：42℃孵育3 min；加入反應(yīng)液Mix，42℃孵育15 min；99℃反應(yīng)3 min。PCR反應(yīng)條件：94℃，2 min；94℃，30 s；57℃，30 s；72℃，1 min，第2步起循環(huán)。PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝片，應(yīng)用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶與β-actin條帶吸光度比值為TNF-α mRNA的相對表達(dá)水平。

表1　PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.6統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0軟件，組間計量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血糖水平模型組大鼠的血糖(29.45±4.82) mmol/L，明顯高于正常對照組(10.83±2.03) mmol/L(P<0.01)；絲膠治療組、陽性對照組大鼠的血糖水平分別為(13.20±4.09) mmol/L、(13.20±2.30) mmol/L，明顯低于模型組(P<0.01)。

2.2大鼠肝臟TNF-α的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，TNF-α蛋白免疫產(chǎn)物為棕黃色和棕褐色顆粒狀，位于肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。與正常對照組大鼠比較，模型組大鼠肝臟TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；絲膠治療組、陽性對照組大鼠肝臟TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)。見圖2、圖3、表2。

圖1　大鼠肝臟TNF-α蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

1：正常對照組，2：模型組，3：絲膠治療組，4：陽性對照組；下表同圖2　蛋白印跡法檢測大鼠肝臟TNF-α蛋白表達(dá)

圖3　RT-PCR法檢測大鼠肝臟TNF-α mRNA的表達(dá)

組別蛋白免疫組化法蛋白印跡法mRNA正常對照組0.325±0.0131)0.403±0.0321)0.502±0.0131)模型組0.541±0.0090.677±0.0520.867±0.032絲膠治療組0.441±0.0071)0.594±0.0461)0.631±0.0181)陽性對照組0.421±0.0031)0.570±0.0441)0.630±0.0171)

與模型組比較：1)P<0.01

3討論

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素分泌相對或絕對不足引起的以糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂為特征的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病〔3〕。其中，T2DM還是一種先天性免疫和慢性炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞因子在T2DM的發(fā)病中發(fā)揮重要作用〔4，5〕。TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的重要因子，參與機體的多種病理生理改變，分泌過量時可造成多臟器損傷〔6〕；另外，TNF-α與胰島素抵抗以及胰島素引起的相關(guān)疾病密切相關(guān)，并且能較好地反映胰島素抵抗的程度〔7，8〕。TNF-α致胰島素抵抗的作用機制包括：①TNF-α通過抑制胰島素受體底物-1的酪氨酸磷酸化，導(dǎo)致激活下游磷酸肌醇激酶-3的能力下降，從而減弱胰島素的信號傳導(dǎo)；使葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)-4的表達(dá)減少，抑制胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運〔9〕。②通過促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪分解及FFA的釋放，參與介導(dǎo)了肝及外周組織的胰島素抵抗〔4〕。③TNF-α還能降低PPARγ mRNA表達(dá)，減少PPARγ的產(chǎn)生引起胰島素抵抗〔10〕。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂〔11〕。本研究結(jié)果亦顯示，糖尿病模型組大鼠肝臟TNF-α蛋白和mRNA的表達(dá)水平升高，與上述理論機制相符合。

絲膠約占蠶繭的25%～30%，在繅絲提取絲素時作為廢料丟棄，不僅造成巨大浪費，也造成了環(huán)境污染。本研究根據(jù)《本草綱目》記載的“蠶繭能煮水治消渴”以及民間蠶繭泡水降血糖的驗方，提取了蠶繭中溶于水的高分子蛋白——絲膠。且前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠對T2DM大鼠血糖升高和血脂代謝紊亂具有明顯的改善和預(yù)防效果，且能有效保護(hù)胰島細(xì)胞損傷〔11,12〕。本研究顯示，絲膠能明顯降低T2DM大鼠肝臟TNF-α和HNF-4α的表達(dá)，提示絲膠可能通過影響TNF-α的表達(dá)改善胰島素抵抗，可能是絲膠降血糖、發(fā)揮抗糖尿病效應(yīng)的機制之一。

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〔2015-02-10修回〕

(編輯李相軍)

Changes of tumor necrosis factor-α expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats and protective actions of sericin

LIU Dong-Hui,WANG Xiao-Jie,SONG Cheng-Jun,etal.

Department of Human Anatomy,Chengde Medical College,Chengde 067000,Hebei， China

【Abstract】ObjectiveTo study the change of tumor necrosis factor(TNF)-α expression in liver of type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats and protective actions of sericin.Methods48 male SD rats were randomly divided into normal control,diabetes model,sericin treatment and positive control groups(n=12).The rats in model group were not given any more treatments,the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin (2.4 g·kg-1·d-1) for 35 d,the rats in positive control group were lavaged with metformin (55.33 mg·kgspan·d-1) for 35 d.SP immunohistochemical stain,Western blot and RT-PCR were used to detect TNF-α protein and mRNA expressions in liver.ResultsCompared with those in normal control group,the TNF-α protein and mRNA expressions in liver of rats in model group were increased obviously (P<0.01).Compared with those in model group,the TNF-α protein and mRNA expressions in liver of rats in sericin treatment and positive control groups were decreased obviously (P<0.01).ConclusionsSericin might improve insulin resistance by down regulating TNF-α expression in liver.

【Key words】Sericin; Type 2 diabetes mellitus; Liver; Tumor necrosis factor-α

通訊作者：陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥防治研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81441133)；河北省自然科學(xué)基金項目(p013406096)

中圖分類號〔〕R587.1〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6011-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.004