蔣　娟　黃學(xué)寬　朱　丹　曾志華　駱　言　張超男

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶　401331)

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電針對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠細(xì)胞角蛋白18表達(dá)的影響

蔣娟黃學(xué)寬朱丹曾志華駱言張超男

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶401331)

摘要〔〕目的觀察電針對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠細(xì)胞角蛋白18(CK18)變化的調(diào)節(jié)規(guī)律，探究其作用機(jī)制。方法取SD大鼠44只，雌性，體質(zhì)量(180±20)g，將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、東寶肝泰組、電針組，每組11只。正常組食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余各組均采用高脂高膽固醇(TC)飼料(含2%膽固醇、10%豬油及88%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)8 w。造模成功后，東寶肝泰組按0.9 g/kg體重灌服，1次/d，共治療28 d；電針組針刺 “肝俞”、“脾俞”、“膈俞”穴，電壓9 V，電流強(qiáng)度1～3 mA，頻率為1.5～2 Hz，疏密波，留針15 min，1次/d，連續(xù)28 d。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫組化法分別檢測(cè)各組大鼠血清及肝組織CK18的變化。結(jié)果ELISA和免疫組化結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組CK18含量與表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，電針組與東寶肝泰組CK18含量與表達(dá)均較模型組下調(diào)(P<0.05)，且電針組明顯優(yōu)于東寶肝泰組(P<0.05)。結(jié)論電針干預(yù)可顯著抑制NAFCD模型大鼠CK18含量和表達(dá)的上調(diào)趨勢(shì)，對(duì)緩解NAFLD肝細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展，減輕肝臟負(fù)荷具有重要作用。

關(guān)鍵詞〔〕電針；非酒精性脂肪肝；細(xì)胞角蛋白18

第一作者：蔣娟(1987-)，女，2011級(jí)在讀碩士，主要從事針灸理論及臨床研究。

非酒精性脂肪肝(NAFLD) 是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪性變和脂肪存積為特征的臨床病理綜合征，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。因脂肪肝可使肝細(xì)胞壞死，進(jìn)一步演變?yōu)楦卫w維化、肝硬化，故早期診治以防止其發(fā)展至關(guān)重要。而細(xì)胞角蛋白(CK)18作為一種從凋亡肝細(xì)胞中釋放出來(lái)的蛋白，與肝臟損傷關(guān)系十分密切。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電針對(duì)NAFLD大鼠CK18含量及表達(dá)的影響，探討電針治療NAFLD的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器總膽固醇(TC)(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：13K10350)；東寶肝泰(通化東寶藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H22024764，批號(hào)：20120411)；CK18酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20121009)；CK18抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司，批號(hào)：20121203)；電針綜合治療儀(重慶醫(yī)療器械廠制造)；80-2型低速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 352型)；洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems AC8)；顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11)；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析處理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus)；恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型)等。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與模型復(fù)制清潔級(jí)雌性SD大鼠44只，體質(zhì)量(180±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物批號(hào)：SCXK渝2007-0001)，大鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常組11只和模型組、東寶肝泰組和電針組，每組11只，正常組食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，造模大鼠以高脂高TC飼料〔1〕(即含2%膽固醇、10%豬油及88%基飼飼料)制造NAFLD模型，喂養(yǎng)8 w。造模第8周末，隨機(jī)抽取正常組大鼠1只和造模大鼠3只(分別從模型組、東寶肝泰組和電針組各抽取1只)，處死，取肝臟進(jìn)行病理切片證實(shí)脂肪肝已形成，說(shuō)明造模成功。

1.3治療方法東寶肝泰組：大鼠灌胃東寶肝泰溶液，按0.9 g/kg體重灌服，1次/d，連續(xù)28 d。電針組：以調(diào)肝健脾、化痰活血為法，電針時(shí)將大鼠放置于大鼠固定器中，大鼠腧穴根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位〔2〕，取雙側(cè)肝俞、脾俞、膈俞，用32#毫針，分別刺入1～7 mm深度，接通電針綜合治療儀，頻率為電壓9 V，電流強(qiáng)度1～3 mA，1.5～2 Hz，疏密波，以大鼠軀干輕微抖動(dòng)為度，保持大鼠狀態(tài)清醒，1次/d，每次15 min，連續(xù)治療28 d。正常組和模型組每天放入大鼠固定器中15 min，不作其他處理，共28 d。

1.4指標(biāo)檢測(cè)在末次治療后禁食24 h，摘取大鼠眼球取血，靜置30 min，低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存待測(cè)。頸椎脫臼處死大鼠，及時(shí)打開(kāi)腹腔，取肝臟左葉相同部位大小肝組織放入10%甲醛中固定，石蠟包埋，切片，染色，光學(xué)顯微鏡下拍照。CK18酶聯(lián)免疫吸附法(ELLSA)檢測(cè)血清，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作；CK18免疫組化法檢測(cè)肝組織，按照SP試劑盒操作，每張切片最少10個(gè)高倍視野，光鏡400倍下觀察。應(yīng)用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)CK18的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，胞質(zhì)棕褐色為陽(yáng)性反應(yīng)，用陽(yáng)性細(xì)胞面積來(lái)標(biāo)示表達(dá)強(qiáng)度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠血清CK18含量的比較與正常組(227 pl)比較，模型組大鼠血清CK18的含量顯著升高(588 pl，P<0.05)；與模型組比較，東寶肝泰組和電針組血清CK18的含量顯著降低(410 pl,P<0.05)；但電針組(309 pl)對(duì)NAFLD模型大鼠血清CK18含量的影響明顯優(yōu)于東寶肝泰組(P<0.05)。

2.2大鼠肝組織免疫組化法CK18表達(dá)的比較CK18免疫組化顯示陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色顆粒，在高倍顯微鏡下觀察每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞率，并對(duì)圖片陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行累積光密度值(IOD)測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組IOD值顯著高于正常組(P<0.05)，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；電針組和東寶肝泰組IOD值顯著低于模型組(P<0.05)，且電針組IOD值低于東寶肝泰組(P<0.05)，可見(jiàn)電針組為弱陽(yáng)性表達(dá)，東寶肝泰組為陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)表1、圖1。

組別陽(yáng)性細(xì)胞率(%)陽(yáng)性細(xì)胞顯示強(qiáng)度IOD正常組0.711.2±0.31)模型組533171.5±15.5東寶肝泰組26369.3±6.21)2)電針組10131.5±4.91)

與模型組比較：1)P<0.05；與電針組比較：2)P<0.05

圖1　大鼠肝組織免疫組化法CK18的表達(dá)(SP法，×400)

3討論

NAFLD發(fā)生的主要原因是脂類(lèi)代謝障礙，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，至今尚未完全闡明。本病在脂肪變性的基礎(chǔ)上常伴有肝細(xì)胞變性壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而炎癥應(yīng)答主要在脂肪組織和肝臟中存在〔3〕，可見(jiàn)小葉內(nèi)炎癥、匯管區(qū)炎癥、匯管區(qū)變性及點(diǎn)狀壞死或壞死灶。目前NAFLD的發(fā)生和發(fā)展可用“兩次打擊”的理論解釋〔4〕，NAFLD因?yàn)楦蝺?nèi)脂類(lèi)代謝不平衡引起的胰島素抵抗(IR)而導(dǎo)致第1次打擊。IR完成后，其受體通過(guò)自身磷酸化激活下游的(MAPK)通路和其相關(guān)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，使炎癥因子和活性氧自由基得以釋放，炎癥因子反應(yīng)過(guò)多，造成第二次打擊，從而加重NAFLD〔5〕。

CK18 是肝細(xì)胞膜骨架重要的組成部分，主要表達(dá)于成熟上皮細(xì)胞的中間絲蛋(IFP)。CK18主要保護(hù)肝細(xì)胞不受到機(jī)械性和非機(jī)械性導(dǎo)致的各種壓力，一般認(rèn)為CK18是肝細(xì)胞凋亡和壞死過(guò)程中的一種相對(duì)特異蛋白，可在肝臟受到損害時(shí)起到“監(jiān)察”作用〔6〕，從而防止肝臟受到進(jìn)一步損害。CK18在肝病領(lǐng)域的意義主要在于識(shí)別輕微的肝臟損傷，轉(zhuǎn)氨酶甚至在正常范圍內(nèi)的輕微肝損。研究表明，通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中CK18水平能較準(zhǔn)確地反映肝臟病理變化〔7〕?？梢?jiàn)電針能調(diào)節(jié)NAFLD模型大鼠血清CK18含量和肝組織CK18的表達(dá)，也是研究NAFLD的新思路和新方法。

有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)雌性大鼠比雄性大鼠更容易受到NAFLD的損傷，故選擇雌性大鼠作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象〔8〕。而針灸是通過(guò)整體調(diào)節(jié)和雙向調(diào)節(jié)作用，以達(dá)到扶正祛邪、疏通經(jīng)絡(luò)以協(xié)調(diào)陰陽(yáng)之目的。有研究對(duì)150例NAFLD肝患者進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)體重指數(shù)(BMI)、TG、空腹血糖(FBG)、(DBP)是NAFLD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，認(rèn)為NAFLD以肝氣郁滯型、濕熱內(nèi)蘊(yùn)型、痰濕內(nèi)阻型、瘀血阻滯型、肝腎陰虛型五種癥候?yàn)橹?，其主要?dú)立危險(xiǎn)因素為BMI、TG、FBG、DBP〔9〕。而應(yīng)用肝脾相關(guān)理論治療NAFLD肝纖維化以提高臨床療效，認(rèn)為其作用機(jī)制之一可能與通過(guò)調(diào)節(jié)瘦素、脂質(zhì)代謝功能有關(guān)〔10〕。也有人認(rèn)為，痰瘀阻絡(luò)是NAFLD形成的基本病機(jī)〔11〕。因此，痰瘀互結(jié)、肝脾失調(diào)應(yīng)是NAFLD形成的主要原因，通過(guò)針刺則可調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)以促進(jìn)脂代謝〔12〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電針“肝俞”、“脾俞”、“膈俞”而達(dá)到消痰化瘀、健脾疏肝等作用。其中肝俞穴具有行氣疏肝的功效，《素問(wèn)》“從陰引陽(yáng)，從陽(yáng)引陰”，因臟病為陰病，背俞穴位于陽(yáng)位，采用俞治臟?。黄⒂峤∑⒒瘽?，可增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)，并能提高多種消化酶的活力，幫助消化以降低血脂、血液黏度；膈俞具有寬胸理氣、活血通絡(luò)的作用，能降低血液黏滯度，使血流加速，改善微循環(huán)。

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〔2014-06-11修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

通訊作者：黃學(xué)寬(1972-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)經(jīng)絡(luò)理論及臨床研究。

基金項(xiàng)目：重慶市衛(wèi)生局科技資助項(xiàng)目(2011-2-146)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R575.5〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6708-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.027