向晶　陳海君　施軍平

[摘要] 目的 探討Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）在高脂高糖飲食誘導的非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）大鼠肝組織中的表達及其意義。 方法 選取SD大鼠20只，隨機分為兩組，模型組SD大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，10周末分別進行如下檢測：①計算肝指數(shù)；②HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病理改變；③應用RT-PCR法檢測大鼠肝組織TLR4、MyD88 mRNA的表達。 結果 模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加（P<0.01）；模型組的NAFLD活動度計分與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88的mRNA表達水平與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。 結論 持續(xù)10周的高脂高糖飲食喂養(yǎng)可以誘導NAFLD大鼠模型，模型組大鼠肝組織TLR4 mRNA和MyD88 mRNA表達升高，在肝細胞炎癥改變中起重要作用。

[關鍵詞] 非酒精性脂肪肝；大鼠；Toll樣受體4；髓樣分化因子88

[中圖分類號] R575.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0024-05

近年來非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢。胡衛(wèi)等[1]對武漢大學醫(yī)學院教職工體檢的調查研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD總患病率達到20.7%，其具體發(fā)病機制尚未完全明確，但大量研究表明胰島素抵抗、炎癥反應、脂質代謝異常在該病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2]。目前研究表明，Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）與感染信號的識別及轉導和機體的損傷密切相關，將感染和炎癥、組織損傷聯(lián)系起來[3]。Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）是內毒素識別受體，目前已知TLR4介導的信號轉導包括髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴性途徑主要介導核因子-κB（nuclear fator-κB，NF-κB）活化、細胞因子的產(chǎn)生[4]。本文通過研究TLR4、MyD88在高脂高糖飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝組織中的表達，旨在探討TLR4、MyD88在NASH炎癥反應中的作用。

1 材料與方法

1.1 非酒精性脂肪性肝炎動物模型的建立

健康雄性Spraque-Dawley大鼠20只，體重180～225 g，清潔級，購買于上海斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬） 2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。20只SD大鼠隨機分為正常組（予普通飼料喂養(yǎng)）10只及模型組10只（予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)）；于第10周處死正常組10只大鼠及模型組10只大鼠，HE染色，光鏡下觀察正常組和模型組大鼠肝組織的病理改變，以證實大鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）模型成功建立。實驗動物每籠5只，分籠飼養(yǎng)，均自由飲水和進食，（20±2）℃明暗各12 h，均連續(xù)10周。

1.2 標本采集

第10周末當晚兩組大鼠禁食不禁水，次日晨空腹腹腔注射麻醉，心臟采血用于測定生化指標和細胞因子；分離整個肝臟稱重，在肝右葉切取數(shù)塊肝組織，裝入凍存管，投入液氮中保存，進入實驗室后移入-80℃冰箱中保存，用于提取總RNA，以檢測肝組織中TLR4、MyD88的mRNA表達。

1.3 病理組織學檢查

常規(guī)HE染色，光鏡下觀察大鼠肝細胞脂肪變性程度、氣球樣變性、小葉內炎癥程度以評定NAFLD活動度計分（NAFLD activity score，NAS），脂肪肝病理組織學診斷參考中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組“非酒精性脂肪肝診斷標準”[5]。根據(jù)肝小葉內脂肪變的肝細胞數(shù)將脂變程度量化：0分（肝小葉內<5%肝細胞脂肪變）、1分（肝小葉內5%～33%肝細胞脂肪變）、2分（肝小葉內34%～66%肝細胞脂肪變）、3分（肝小葉內>66%肝細胞脂肪變）。肝小葉內炎癥（20倍鏡計數(shù)壞死灶）計分：0分（無壞死灶）、1分（<2個壞死灶）、2分（2～4個壞死灶）、3分（>4個壞死灶）。肝細胞氣球樣變程度計分：0分（無氣球樣變）、1分（少見氣球樣變）、2分（多見氣球樣變）。NAFLD活動度計分（NAFLD activity score，NAS）為肝細胞脂肪變+小葉內炎癥+肝細胞氣球樣變，NAS小于3分則不考慮NASH，NAS大于4分則可診斷NASH，介于兩者之間為NASH可能。

1.4 RT-PCR檢測TLR4、MyD88 mRNA在NASH大鼠肝組織中的表達

1.4.1 總RNA提取 從超低溫冰箱中取出冰凍的組織，約為100 mg，迅速轉移至用液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，直至研磨成粉末狀，向研缽中加入2 mL RNAiso Plus，完全覆蓋研磨成粉末狀的樣品，靜置室溫中，待樣品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明狀，將勻漿液轉移至2個1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中。離心之后，吸取上清液，移入新的1.5 mL無RNA酶和無DNA酶的離心管中，向新的勻漿裂解液中加入0.2 mL氯仿，用手劇烈震蕩15 s，12 000 r 4℃離心15 min，吸取上清液轉移至另一新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10 min，再次12 000 r 4℃離心10 min，棄去上清，加入75%的乙醇1 mL洗滌并干燥。最后用40～50 μL的DEPC處理水溶解RNA。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計測定提取物的濃度，OD260/280比值在1.8～2.0之間。

1.4.2 合成相關引物 從有關資料獲得所需引物，并在基因庫（Genebank）中進行核對。引物序列見表1，由上海Invitrogen 公司合成。

1.4.3 逆轉錄反應 用上述細胞中提取的2 μL總RNA加入0.2 mL離心管中，于70℃溫育10 min，短暫離心后置于冰上。依據(jù)如下順序加入以下試劑以建立一個20 μL的反應體系：MgCl2（25 mM）4 μL ，反轉錄10×緩沖液2 μL，dNTP混合物（10 mM）2 μL，重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑0.5 μL，AMV反轉錄酶0.6 μL，隨機引物1 μL，無核酸酶的水7.9 μL，總RNA 2 μL。將反應體系于室溫溫育10 min，于42℃溫育60 min，于95℃加熱5 min，再于4℃放置5 min。即為cDNA，放入-30℃存放。

1.4.4 PCR反應 取上述逆轉錄反應體系于18 μL反應體系中進行PCR反應。反應體系組成如下：2×Taq PCR Master Mix 9 μL，TLR4、MyD88上游引物 2 μL，TLR4、MyD88下游引物 2 μL，β-actin上游引物 2 μL，β-actin下游引物 2 μL，去離子水1 μL。變性94℃ 30 sec，退火58℃ 30 sec，延伸72℃ 30 sec，4℃冷卻5 min結束反應。按上述條件循環(huán)25次，最后2%瓊脂糖凝膠電泳20 min。應用BIO-RAD圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描，計算TLR4/β-actin及MyD88/β-actin的比值。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01表示差異有高度統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠體重及肝指數(shù)比較

實驗期間正常組大鼠靈活，精力充沛，皮膚有光澤，體重逐漸增加；模型組大鼠造模時體重較正常組逐漸增加，糞便粘臭，毛發(fā)失去光澤，漸油膩，實驗初期活動與正常組無異，第5周后大鼠活動明顯減少，體態(tài)笨重。由表2可見模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加（P<0.01）。

2.2 兩組大鼠病理組織學變化及NAFLD活動度計分比較

通過光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠肝臟組織肝小葉結構完整；肝細胞呈多邊形圍繞中央靜脈呈放射狀分布，大小較一致，核結構清晰可見，肝竇清晰可見。模型組大鼠肝細胞脂肪變性明顯，主要以小泡性為主，偶爾可見重度脂肪變性，小葉內可見淋巴細胞浸潤形成的點灶狀壞死，見圖1。模型組的NAFLD活動度計分（NAFLD activity scores，NAS）與正常組比較有顯著差異（P<0.01），證實NASH模型成功建立，見表3。

2.3 兩組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達比較

用RT-PCR法分別檢測NASH大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達，TLR4和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結果顯示擴增片段為266 bp和149 bp，與預期設計的目的片段大小相同；MyD88和β-actin的RT-PCR產(chǎn)物電泳結果顯示擴增片段為191 bp和309 bp，與預期設計的目的片段大小相同，見圖2。模型組大鼠肝組織TLR4和MyD88 mRNA的表達水平與正常組比較有顯著差異（P<0.01），見表4。

3討論

NAFLD是指除大量飲酒、遺傳疾病、成脂藥物影響等導致的肝脂肪病，影像或者病理證實存在肝臟脂肪變的一種代謝性疾病[6，7]，包括非酒精性單純性脂肪肝（non-alcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、脂肪肝相關肝硬化。隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢，NAFLD現(xiàn)已成為歐美等發(fā)達國家和我國富裕地區(qū)慢性肝病的重要病因。研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD漫長的病程中，NAFLD患者肝臟一般呈靜止狀態(tài)，隨訪10～20年肝硬化發(fā)生率僅0.6%～3%，而NASH患者10年內肝硬化發(fā)生率為15%～25%[8]，NASH為NAFLD發(fā)生肝硬化的限速步驟，因此，NAFLD引起了臨床醫(yī)師極大關注，其防治研究成為醫(yī)學研究的熱門課題之一。

目前其發(fā)病機制尚不十分清楚，以1998年Day CP[9]提出的“二次打擊學說”最為著名，即各種原因如肥胖、2型糖尿病、脂代謝紊亂等導致的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），游離脂肪酸增加，肝臟脂肪代謝障礙，從而使肝細胞內合成三酰甘油增加而輸出減少，導致過量的肝臟脂質聚積，并使肝臟易受第二次打擊是“二次打擊學說”的第一步；線粒體脂肪酸氧化引起的氧化應激，核因子-κB（nuclear fator-κB，NF-κB）依賴的炎癥細胞因子表達和脂肪細胞因子是所有的被認為是導致第二次打擊產(chǎn)生肝細胞損傷、炎癥和纖維化的潛在因素[10，11]。

本研究組成員蔣艷明等[12]利用高脂高糖飲食喂養(yǎng)建立NAFLD模型，已證明其可靠性，本實驗亦采用高脂高糖喂養(yǎng)誘導NAFLD大鼠模型，大鼠肝臟HE染色顯示肝臟脂肪變性程度加深、脂滴沉積，并可見炎癥細胞浸潤，具有典型NAFLD病理表現(xiàn)，并檢測模型組大鼠肝組織中TLR4和MyD88的表達。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類最重要的模式識別受體，可識別內源性的損傷信號相關分子模式和微生物的病原學相關分子模式，是近年來發(fā)現(xiàn)的在免疫應答中起重要作用的細胞表面受體分子，其不僅激活先天性免疫應答，還引起細胞因子的釋放，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，對獲得性免疫具有重要的影響[13，14]。此類受體的基因最早在果蠅體內發(fā)現(xiàn)，介導天然免疫，能感受入侵的病原體。TLR家族至少已包括13個成員，不同的TLR配體也有所不同。Medzhitov R等[15]首次在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)與果蠅中Toll受體結構同源的受體蛋白，后來命名為Toll樣受體，主要表達于單核巨噬細胞膜上，樹突狀細胞、B細胞以及表皮細胞、脂肪細胞、成纖維細胞也有表達。其屬于Ⅰ型跨膜蛋白（type Ⅰ transmembrance protein）受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)組成。胞外區(qū)為一段富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeat，LRR），可與CD14 結合，參與各種病原體的識別；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結構域；胞內區(qū)是一段約有200個氨基酸的序列，該序列與白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體胞內區(qū)具有同源性，所以又稱為Toll/IL-1 受體同源區(qū)（Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR），是TLRs向下游進行信號傳遞的核心元件。當TLR4與相應配體結合后，信號轉導到TIR區(qū)域，然后進一步激活核因子κB（nuclear factor-κB）、絲裂原蛋白激酶信號通路，誘導促炎細胞因子如腫瘤壞死因子和白介素等基因的表達[16]。

目前經(jīng)TLR4介導的信號轉導包括髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性和非依賴性途徑。MyD88依賴通路通過MyD88和IL-1受體相關激酶（interleukin-1 receptor-assciated kinase，IRAK）相互作用，募集TNF-受體相關因子6（tumor necrosis fator receptor-assciated fator 6，TRAF6），激活的TRAF6導致IκB激酶復合物活化，最終導致NF-κB、P38、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）激活，進一步形成AP-1轉錄因子，從而誘導產(chǎn)生炎癥因子。徐正婕等[17]通過建立大鼠NASH模型，觀察肝臟內毒素受體表達的動態(tài)變化，結果發(fā)現(xiàn)實驗8周時肝臟CD14和TLR4表達較正常組增高，12周進行性增高，并于16周達到高峰。Gao Y等[18]發(fā)現(xiàn)NASH患者體內TLR4、LBP、TNF-α的水平明顯高于對照組，推測NASH的發(fā)病可能與TLR4及LPS的表達增高有關。Liu J等[19]對TLR4野生型和突變型小鼠給予高脂高糖飲食，發(fā)現(xiàn)分別在第4、8、16周出現(xiàn)野生型小鼠肝臟脂肪沉積、脂肪沉積合并炎癥以及纖維化，TLR4、MyD88表達在第4周增加，第8周達到高峰，突變型小鼠肝臟脂質沉積則相對減輕，說明TLR4參與NAFLD的炎癥和纖維化進程。劉濤等[20]采用高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型，檢測NAFLD組和正常組TLR4、MyD88肝組織mRNA和蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)NAFLD組大鼠肝組織中TLR4、MyD88表達均增高，差異有統(tǒng)計學意義，研究認為TLR4信號在NAFLD大鼠模型中高表達，說明其參與NAFLD的炎癥和纖維化進程。且Jagavelu K等[21]研究發(fā)現(xiàn)必須依賴MyD88的TLR4信號途徑，內毒素才能促進炎癥的產(chǎn)生。

本研究中，模型組的肝指數(shù)較正常組明顯增加，并且模型組的NAS與正常組比較有顯著差異，在分子水平模型組TLR4 mRNA表達水平明顯高于正常組，同時作為TLR4下游蛋白的MyD88的mRNA結果也明顯增高。綜上所述，TRL4 介導的炎性反應可能是導致非酒精性脂肪性大鼠肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展的原因之一。

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（收稿日期：2016-07-12）