任路平　于　賢　宋光耀　孫　文　李　凡　陳樹春

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌一科，河北　石家莊　050000)

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高果糖、高脂喂養(yǎng)致小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時(shí)程變化

任路平于賢宋光耀孫文李凡陳樹春

(河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌一科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討高果糖與高脂飲食對(duì)比誘導(dǎo)的小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的發(fā)生時(shí)程變化。方法雄性C57BL/J6小鼠分為對(duì)照組、高果糖組及高脂組，分別在喂養(yǎng)3 d、8 w后測(cè)定各組小鼠空腹血糖(FPG)、空腹血清胰島素(FINS)、肝臟甘油三酯(TG)含量，并測(cè)定各組小鼠肝臟ERS標(biāo)志物——磷酸化胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK)及磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE1/t-IRE1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果喂養(yǎng)3 d后，與對(duì)照組相比，兩組FPG、FINS無明顯變化，而肝TG水平均顯著增加；喂養(yǎng)8 w后，與對(duì)照組相比，兩組FPG、FINS、肝TG水平均顯著增加；喂養(yǎng)3 d后，與對(duì)照組相比，高果糖組的肝內(nèi)p-PERK、p-IRE1蛋白表達(dá)顯著增加，提示出現(xiàn)ERS，而高脂組GRP78、p-PERK的蛋白表達(dá)與對(duì)照組無顯著區(qū)別；喂養(yǎng)8 w后，高果糖、高脂組的肝內(nèi)p-PERK、p-IRE1蛋白表達(dá)均顯著增加。結(jié)論短期和長(zhǎng)期高果糖和高脂喂養(yǎng)均可引起肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，但高果糖喂養(yǎng)小鼠在脂肪肝發(fā)生早期即可出現(xiàn)肝ERS，而高脂喂養(yǎng)小鼠則在長(zhǎng)期喂養(yǎng)后方出現(xiàn)肝ERS，提示ERS與高果糖、高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝發(fā)生發(fā)展均有關(guān)，但介導(dǎo)機(jī)制不同。

關(guān)鍵詞〔〕甘油三酯；脂肪肝；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

第一作者：任路平(1977-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌脂代謝學(xué)研究。

果糖和脂類是引起肝內(nèi)脂肪沉積的兩個(gè)重要的飲食因素，嚙齒類的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期的果糖、脂類的過量攝入(短期及長(zhǎng)期喂養(yǎng))均可引起肝內(nèi)甘油三酯(TG)等脂質(zhì)沉積〔1,2〕。研究表明，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)可能參與了脂肪肝的發(fā)生發(fā)展〔3〕。然而，尚無研究比較兩種不同飲食因素誘導(dǎo)脂肪肝的發(fā)生時(shí)期與ERS的關(guān)系。本研究旨在進(jìn)一步探討ERS在飲食誘導(dǎo)脂肪肝中的介導(dǎo)作用。

1材料和方法

1.1模型建立成年雄性C57BL/J6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組、高果糖組及高脂組，每組30只，體重24～27 g。對(duì)照組進(jìn)食普通飼料(淀粉69%，脂肪10%，蛋白質(zhì)21%)；高果糖組飼料配方：淀粉34.5%，果糖34.5%，脂肪9%，蛋白質(zhì)21%；高脂組飼料配方：淀粉20%，脂肪59%，蛋白質(zhì)21%。三組小鼠每日進(jìn)食熱量基本相等，于喂養(yǎng)3 d后行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，并每組處死15只小鼠，留取肝臟組織；余小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)至8 w后行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定，處死小鼠，留取肝臟組織。

1.2檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1血清指標(biāo)測(cè)定各組小鼠于不同時(shí)期自尾尖取血，分離血清，空腹血糖(FPG)采用快速血糖測(cè)定儀測(cè)定；空腹血清胰島素(FINS)采用放射免疫法測(cè)定。

1.2.2肝臟TG測(cè)定取肝臟組織20～30 mg，經(jīng)氯仿/甲醇抽提TG后，應(yīng)用TG檢驗(yàn)測(cè)試試劑盒(GPO-PAP)測(cè)定TG含量。

1.2.3Western印跡法測(cè)定蛋白含量每組隨機(jī)選6例樣本進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。取肝組織30 mg加入RIPA 裂解液制成勻漿，用低溫離心機(jī)13 000 r/min離心5 min，取20 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉后加入1∶1 000稀釋的抗體，單抗4℃孵育過夜；加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)Plus 發(fā)光顯色，X線底片壓片、顯像。內(nèi)參抗體Pan14-3-3。用IMAGEJ軟件分析目的蛋白表達(dá)相對(duì)含量。磷酸化胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(p-PERK)抗體由cell signaling公司提供(#3191)，磷酸化山梨醇要求激酶-1(p-IRE-1)抗體、總IRE-1抗體、Pan14-3-3由ABCAM公司提供(ab48187，ab48189，ab12341)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)3 d、8 w后各組小鼠指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果各組小鼠實(shí)驗(yàn)起始體重?zé)o差異，喂養(yǎng)3 d后，不同飼料體重增長(zhǎng)無明顯區(qū)別，高果糖組、高脂組的FBG、FINS與對(duì)照組比較無差異(P>0.05)，喂養(yǎng)8 w后，各組小鼠體重增長(zhǎng)無明顯區(qū)別，但高果糖組、高脂組的FBG、FINS均顯著高于對(duì)照組，高果糖組、 高脂組之間無顯著區(qū)別。實(shí)驗(yàn)3 d、8 w后，與對(duì)照組相比，高果糖組、高脂組的肝臟TG水平均顯著增高(P均<0.01)，其中高果糖組高于高脂組(P<0.01)。見表1。

組別體重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝臟TG(μmol/g)3d對(duì)照組25.1±0.45.9±0.30.18±0.0410.65±0.54 高果糖組25.4±0.66.1±0.50.19±0.0326.28±0.671 高脂組 25.3±0.76.0±0.40.19±0.0524.69±0.991)2)組別體重(g)FPG(mmol/L)FINS(nmol/L)肝臟TG(μmol/g)8w對(duì)照組28.9±0.66.4±0.40.23±0.0713.72±0.67 高果糖組29.1±0.87.6±0.41)0.38±0.041)30.82±1.761) 高脂組 29.2±0.97.5±0.51)0.35±0.061)29.56±1.531)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01;與高果糖組比較：2)P<0.05

2.2各組肝臟ERS標(biāo)志物表達(dá)情況喂養(yǎng)3 d后，與對(duì)照組相比，高果糖組反映ERS的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1蛋白表達(dá)明顯增加(P均<0.01)，而高脂組與對(duì)照組無顯著差別(P均>0.05)(圖1)。喂養(yǎng)8 w后，與對(duì)照組相比，高果糖組、高脂組的p-PERK、p-IRE1/t-IRE1的蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.01)(圖2)。

圖1　喂養(yǎng)3 d后各組肝臟ERS標(biāo)志物表達(dá)情況

圖2　喂養(yǎng)8 w后各組肝臟ERS標(biāo)志物表達(dá)情況

3討論

關(guān)于飲食攝取的流行病學(xué)研究表明，脂類和果糖的過量攝入與非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔4,5〕。既往研究表明，短期(喂養(yǎng)3 d或1 w)的脂類、果糖過量攝入即可引起肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積〔1,6〕，本研究結(jié)果和既往研究結(jié)果一致，高果糖、高脂喂養(yǎng)3 d后即出現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)TG含量升高；同時(shí)，在喂養(yǎng)8 w后，高果糖、高脂飲食喂養(yǎng)小鼠均存在持續(xù)的肝臟脂質(zhì)沉積。通過短期、長(zhǎng)期的兩種飲食喂養(yǎng)，本研究證實(shí)了果糖、脂類的過量攝入對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的危害。

肝細(xì)胞具有多種合成代謝的功能，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多功能的細(xì)胞器，特別是在肝細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)責(zé)合成脂類，也加工各種蛋白包括脂肪合成酶類，對(duì)能量代謝的變化很敏感。近年，ERS在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用被認(rèn)識(shí)到。不同角度的研究發(fā)現(xiàn)，ERS與脂肪肝的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。以往研究發(fā)現(xiàn)，在ob/ob小鼠(遺傳性肥胖)和長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)的嚙齒類動(dòng)物模型中，隨著脂肪肝的出現(xiàn)，亦伴有肝內(nèi)ERS〔3〕；而4-苯基丁酸(4-PBA)可通過抑制ERS減輕ob/ob小鼠內(nèi)的肝臟TG含量〔7〕。前期研究也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)可在誘導(dǎo)小鼠脂肪肝的同時(shí)誘導(dǎo)肝臟出現(xiàn)ERS〔2〕。但是，目前尚無研究比較不同時(shí)期高果糖、高脂飲食誘導(dǎo)脂肪肝中ERS的時(shí)程變化。本研究結(jié)果提示，ERS貫穿了高果糖飲食誘導(dǎo)的脂肪肝的發(fā)生發(fā)展的始終，而僅僅出現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)合成的后期。這種不一致的時(shí)程變化提示ERS在兩種飲食介導(dǎo)的脂肪肝中可能發(fā)揮著不同的介導(dǎo)作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有復(fù)雜的功能，分子學(xué)研究表明，ERS不僅可通過刺激脂質(zhì)合成促進(jìn)肝臟脂質(zhì)堆積及脂肪肝的早期發(fā)生，同時(shí)可參與脂肪肝發(fā)展后期的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等事件〔3〕。ERS在兩種飲食中的不同時(shí)程改變可能與果糖、脂類通過不同機(jī)制誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積有關(guān)。首先，果糖作為一個(gè)強(qiáng)烈的刺激肝臟脂質(zhì)從頭合成的飲食因子，可促進(jìn)脂質(zhì)合成上游因子(如SREBP-1，ChREBP等)的上調(diào)，繼而促進(jìn)脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達(dá)增加，引起內(nèi)源性脂質(zhì)合成增多而致肝細(xì)胞內(nèi)TG等脂質(zhì)堆積。本課題組前期研究表明，3 d及8 w果糖過量攝入后，嚙齒類動(dòng)物肝臟內(nèi)的脂質(zhì)合成相關(guān)酶類，包括乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰CoA脫飽和酶(SCD)-1和脂肪酸合成酶(FAS)的蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)〔2,6〕，提示脂質(zhì)從頭合成增強(qiáng)是短期、長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)引起脂肪肝的重要機(jī)制之一。不同的分子生物學(xué)研究表明，ERS中的非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)通路可刺激脂質(zhì)從頭合成，目前認(rèn)為UPR的PERK-eIF2α和IRE-1-XBP-1通路介導(dǎo)了的脂質(zhì)從頭合成。一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過減少eIF2α的磷酸化抑制了PERK-eIF2α通路的激活，發(fā)現(xiàn)PERK-eIF2α通路的抑制可減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，揭示了此條UPR通路具有調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成的作用〔8〕；一個(gè)XBP-1基因敲除小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，XBP-1基因可調(diào)控SCD-1和ACC2的表達(dá)，從而影響了脂質(zhì)代謝，XBP-1基因?qū)嶋H上是調(diào)控肝臟脂質(zhì)從頭合成的一個(gè)新的上游轉(zhuǎn)錄因子〔9〕；另外，在ob/ob小鼠中，ERS伴侶分子GRP78的過表達(dá)可促進(jìn)脂質(zhì)合成上游轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的活化，從而促進(jìn)SREBP-1c靶基因表達(dá)的上調(diào)〔10〕。這些研究均提示ERS通過影響肝臟內(nèi)源性的脂質(zhì)合成而介導(dǎo)了脂肪肝的發(fā)生。高果糖喂養(yǎng)3 d后，小鼠肝內(nèi)ERS可能通過刺激肝內(nèi)脂質(zhì)從頭合成參與了果糖誘導(dǎo)脂肪肝的始動(dòng)發(fā)生環(huán)節(jié)。

與此相反，高脂喂養(yǎng)通過不同的機(jī)制引起脂肪肝。由于高脂飲食(棕櫚酸為主要成分)中提供了機(jī)體需要量以外的過多的外源性脂質(zhì)，流入肝臟的外源性飽和脂肪酸增多，刺激了甘油磷酸脂酰轉(zhuǎn)移酶(GPAT)活化，GPAT的活化進(jìn)一步使TG和脂蛋白的合成增加，導(dǎo)致了肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積而引起脂肪肝〔11〕。既往研究表明，與高果糖喂養(yǎng)相反，高脂喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ACC、FAS和SCD-1的蛋白表達(dá)均下調(diào)，原因是過多的外源性脂肪酸抑制了肝內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成通路〔1,2〕。因此，這可能解釋了本研究中ERS未出現(xiàn)于短期高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪肝的原因，提示在高脂喂養(yǎng)小鼠中，肝臟脂質(zhì)沉積早于ERS的出現(xiàn)，ERS并未介導(dǎo)高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝的早期發(fā)生。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)后小鼠肝內(nèi)出現(xiàn)了ERS，支持了ERS在高脂喂養(yǎng)脂肪肝后期發(fā)展中的介導(dǎo)作用。在脂肪肝持續(xù)存在的過程中，肝細(xì)胞內(nèi)過量的脂質(zhì)負(fù)荷活化了ERS，引起了UPR，持久的UPR及持續(xù)的ERS則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、組織炎癥及壞死，參與了脂肪肝的后期發(fā)展〔12〕。

ERS在果糖、脂類所誘導(dǎo)的脂肪肝中發(fā)揮了不同的作用。兩種不同飲食因子在不同時(shí)期誘發(fā)了肝臟ERS，ERS介導(dǎo)了果糖過量攝入所誘導(dǎo)的脂肪肝早期的發(fā)生發(fā)展，ERS可能是果糖誘導(dǎo)脂肪肝的始動(dòng)因素之一；而ERS不是高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝的早期細(xì)胞事件，而發(fā)生于肝脂質(zhì)合成發(fā)生后期，提示ERS并不是脂類誘導(dǎo)脂肪肝的始動(dòng)因素，而可能參與了脂肪肝后期所出現(xiàn)炎癥、氧化應(yīng)激等細(xì)胞事件；具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入的分子生物學(xué)研究。

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〔2014-11-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：宋光耀(1958-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌脂代謝學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(No.81200639)

中圖分類號(hào)〔〕R333.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)23-6694-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.020