教忠意,楊　湘,何開躍

(1. 江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇　南京　211153；2. 南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇　南京　210037)

高苦楝素含量苦楝優(yōu)良單株初步選擇

教忠意1,楊湘2,何開躍2*

(1. 江蘇省林業(yè)科學研究院，江蘇南京211153；2. 南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇南京210037)

摘要：用超聲波萃取法提取供試苦楝根皮、莖皮、果實、果梗、葉片和葉柄內(nèi)的苦楝素，用高效液相色譜法測定苦楝素含量，并采用多重比較和聚類分析等方法進行苦楝高苦楝素含量優(yōu)良單株初選。結(jié)果表明：6個部位中苦楝素含量高低為根皮>莖皮>果實>果梗>葉片>葉柄。初選出適合矮林作業(yè)的單株4株，適合果林經(jīng)營的備選單株6株。

關(guān)鍵詞：苦楝；苦楝素；優(yōu)良單株;高效液相色譜

文章編號：1001-7380(2015)05-0010-04

收稿日期：2015-08-10；修回日期：2015-8-30

基金項目：江蘇省科技支撐計劃項目“速生耐鹽楝樹優(yōu)良品種選育”(BE2012347)；江蘇省林業(yè)三新工程項目“耐鹽速生楝樹新無性系區(qū)域試驗及栽培技術(shù)研究”(LYSX[2014]20)

作者簡介：教忠意(1978-)，男，遼寧鳳城人，副研究員，碩士，主要從事林木遺傳育種、園林植物應用和景觀生態(tài)研究。

通信作者：*何開躍(1959-)，女，四川重慶人，教授，博士，主要從事植物生理生化研究。

中圖分類號：S792.33

文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1001-7380.2015.05.003

Selection of superior individuals ofMeliaazedarachL.

for high toosendanin content

JIAO Zhong-yi1,YANG Xiang2,HE Kai-yue2*

(1.Jiangsu Academy of Forestry, Nanjing 211153，China;

2.College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037,China)

Abstract：In order to broaden the application of Melia azedarach and guide the related productive practice, fine individuals for high content of toosendanin were selected. The toosendanin was extracted from their velamen, bark, fruit, fruit stalks, leaves and petioles by ultrasonic method. The content of toosendanin was measured by HPLC. Then, fine individuals were primarily selected by multiple comparison and cluster analysis. The result showed that the content of toosendanin was the highest in the velamen and bark, followed by fruit, fruit stalks, leaves and petioles. Four individuals with coppicing and 6 individuals with fruit forest management were primarily determined.

Key words：Melia azedarach L.; Toosendanin; Superior individual;HPLC

苦楝(MeliaazedarachL.)為楝科楝屬落葉喬木，其內(nèi)含物具有殺蟲、抑菌活性，至今已被開發(fā)應用于醫(yī)藥、生物農(nóng)藥、化妝品和洗滌用品等生產(chǎn)[1]?？嚅刈鳛樗沫h(huán)三萜類化合物，是苦楝內(nèi)含物中主要的殺蟲活性成分，具有廣譜、低毒、低殘留等優(yōu)點[2-5]。目前，國內(nèi)苦楝內(nèi)含物研究多集中于分析、測定和應用，苦楝素含量高的良種選育方面報道不多。陳涵等[6]比較了福建6個種源和全國17個種源的苦楝皮、果、葉提取物中苦楝素的含量，篩選出了優(yōu)質(zhì)種源?？掠耔T[7]對國內(nèi)15個苦楝種源進行研究，篩選出適于矮林作業(yè)的優(yōu)良種源7個；對福建境內(nèi)選出的128株苦楝優(yōu)良單株進行測定，篩選出果實中苦楝素含量高的優(yōu)良單株9株。上述研究以福建種源居多，研究部位以苦楝樹皮、葉片和果實為主，未涉及根皮等其他部位。因此，在江蘇沿海開發(fā)戰(zhàn)略實施的背景下，對江蘇本地適生苦楝進行各部位苦楝素含量的研究，從源頭提高苦楝素產(chǎn)出率，對工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們生活水平的提高，以及生態(tài)環(huán)境的改善都具有重要的意義。

1材料與方法

1.1　試驗材料

供試材料為江蘇省林業(yè)科學研究院經(jīng)過前期優(yōu)選而獲得的具有生長優(yōu)勢的優(yōu)良苦楝無性系根段扦插繁殖苗，全部生長于江蘇省大豐林場同一立地條件下。選取4年生健壯無病蟲害的苦楝單株15株，分別編為1～15號，采集苦楝的根皮、莖皮、果實、果梗、葉片和葉柄鮮樣。

1.2　試驗方法

姜萍等[8]通過對比研究認為超聲波提取法是苦楝素提取的最好方法，因此本試驗亦采用此方法。2009年11月15日采集苦楝的根皮、莖皮、果實、果梗、葉片和葉柄，于實驗室進行苦楝素的分離。取一定量的苦楝樣品，洗凈烘干，粉碎過40目篩。然后取粉碎后的上述樣品5 g，裝入圓底燒瓶，加入50 mL石油醚，于50 ℃水浴中進行超聲波萃取10 min，靜置后棄去石油醚，重復3次。再加95%乙醇45 mL，50 ℃超聲波萃取40 min用濾紙過濾，殘渣再用乙醇浸提，重復3次。合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，減壓濃縮濾液，揮發(fā)去乙醇。濃縮的濾液呈膏狀物。苦楝素的定量測定：取上述濃縮的濾液用甲醇溶解，定容至5 ml，得樣品制備液，過0.45 μm濾膜，后置液相色譜所用的樣品瓶中，進行HPLC檢測，色譜柱：VP-ODS 150×4.6 mm，柱溫：30 ℃，流動相：甲醇-H2O(體積分數(shù)60∶40)，經(jīng)抽濾后使用，流速：1.0 mL/min，UV檢測波長：215 nm，洗柱時間：5 min，進樣分析時間20 min，記錄樣品峰中苦楝素峰面積值，用回歸方程計算樣品中苦楝素的含量。定性方法：保留時間+標準加入法；定量方法：標準曲線法+標準加入法[9]。

標準曲線的繪制：準確稱取一定量的苦楝素純品于容量瓶中，用甲醇定容，得到1 000 μg/mL的苦楝素標準貯備液。由苦楝素標準貯備液用色譜級甲醇配置成10，20，30，40，50 μg/mL系列質(zhì)量濃度的標準工作液。將上述系列液分別進樣20 μL，在液相色譜儀上測定峰面積，用測得的各峰面積與對應的標準溶液的苦楝素濃度繪制標準曲線。

1.3　統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理和表格制作通過 Excel軟件完成，數(shù)據(jù)分析通過SPSS15.0和DPS軟件完成。

2結(jié)果與分析

2.1　線性相關(guān)性測定

在試驗選定的色譜條件下，苦楝素標準品色譜如圖1所示。在該色譜條件下進行相同體積的進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖可得一條直線，苦楝素的質(zhì)量濃度在10～50 μg/mL之間有很好的線性相關(guān)性，線性方程為Y=aX+b，a= 1.762 502 e-0.04，b=0.190 806 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 400 0。

圖1　苦楝素的HPLC標準色譜

2.2　不同部位苦楝素含量測定

采集15株供試苦楝的根皮、莖皮、果實、果梗、葉片、葉柄樣品，分別測定其苦楝素含量(見表1)。上述參試各苦楝部位中均含有苦楝素，且每個部位中苦楝素含量的變異幅度較大。供試苦楝單株參試部位苦楝素含量均值為0.903～2.336 μg/mg，苦楝單株苦楝素含量差異較大?？嚅睾孔罡叩?4號單株為平均值的1.99倍，是含量最低的8號單株的2.59倍。15株供試苦楝中，苦楝素含量高于平均值的有4株，分別為14號、12號、9號、13號，占供試苦楝總數(shù)的26.67%。對供試苦楝6個參試部位苦楝素含量進行多重比較(見表2)可知，苦楝素平均含量由大到小依次為根皮、莖皮、果實、果梗、葉片、葉柄，其中最大值為根皮2.305μg/mg，是最小值葉柄含量的5.08倍。根皮和莖皮中苦楝素含量均超過2μg/mg，且差異不顯著，并與果實、果梗、葉片和葉柄存在顯著差異；果實、果梗、葉片和葉柄中苦楝素含量差異不顯著。

表1　供試苦楝6個部位苦楝素含量　μg/mg

表2供試苦楝6個部位中苦楝素含量的多重比較

部位苦楝素含量/(μg/mg)部位苦楝素含量/(μg/mg)根皮2.305±0.247aA果梗0.621±0.068bB莖皮2.258±0.295aA葉片0.560±0.108bB果實0.854±0.171bB葉柄0.454±0.113bB

不同大、小寫字母分別表示差異達到0.01和0.05顯著水平。

2.3　用于矮林作業(yè)的優(yōu)良單株選擇

分別對參試苦楝的莖皮、葉片和葉柄3個部位的苦楝素含量進行聚類分析(見圖2～4)。依莖皮中苦楝素含量聚類分析結(jié)果(見圖2)，可將參試苦楝劃分為4類，即苦楝素含量較高的9號、12號和14號，苦楝素含量高的1號、2號、3號、5號、7號和13號，苦楝素含量一般的6號、8號、10號、11號和15號，苦楝素含量較低的4號。依葉片中苦楝素含量聚類分析結(jié)果(見圖3)，可將參試苦楝劃分為3類，即苦楝素含量較高的6號、7號、8號、10號、11號、13號、14號和15號，苦楝素含量一般的1號和4號，苦楝素含量較低的2號、3號、5號、9號和12號。依葉柄中苦楝素含量聚類分析結(jié)果(見圖4)，可將參試苦楝劃分為3類，即苦楝素含量較高的2號、4號、6號、11號和14號，苦楝素含量一般的7號和12號，苦楝素含量較低的1號、3號、5號、8號、9號、10號、13號和15號。適合矮林作業(yè)的苦楝應具備地上部分苦楝素含量高的特點，又地上部分中尤以莖皮的苦楝素含量最高。綜合上述，可初步認為7號、9號、12號和14號供試苦楝單株適于矮林作業(yè)。

圖2　莖皮苦楝素含量聚類分析

圖3　葉片苦楝素含量聚類分析

圖4　葉柄苦楝素含量聚類分析

2.4　用于果林經(jīng)營的備選單株選擇

分別對參試苦楝的果實和果梗的苦楝素含量進行聚類分析(見圖5，6)。依果實中苦楝素含量聚類分析結(jié)果(見圖5)，可將參試苦楝劃分為3類，即苦楝素含量較高的5號、14號和15號，苦楝素含量高的2號、9號和12號，苦楝素含量低的1號、3號、4號、6號、7號、8號、10號、11號和13號。依果梗中苦楝素含量聚類分析結(jié)果(見圖6)，可將參試苦楝劃分為4類，即苦楝素含量較高的11號和12號，苦楝素含量高的2號，苦楝素含量一般的1號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號、10號和13號，苦楝素含量低的14號和15號?？嚅刂饕杏诳嚅母?、莖皮和果實等部位，因此，在實際生產(chǎn)中，苦楝除可用于矮林作業(yè)外，果林經(jīng)營亦是重要的經(jīng)營方式之一，且果林經(jīng)營不破壞植株，僅采收果實，目前應用較廣。但因果林經(jīng)營需結(jié)合單株果實產(chǎn)量進行綜合評判，因此初步認為2號、5號、9號、12號、14號和15號供試苦楝單株可作為果林經(jīng)營的備選單株。

圖5　果實苦楝素含量聚類分析

圖6　果?？嚅睾烤垲惙治?/p>

3討論

通過對參試苦楝單株的根皮、莖皮、果實、果梗、葉片和葉柄等6個部位中苦楝素含量的測定，發(fā)現(xiàn)各部位均含有苦楝素，且根皮和莖皮中苦楝素含量較高，這與韓玖、張峰、顏瀅等[10-12]的研究結(jié)果相似，但與張民力等[13]試驗中關(guān)于果實中僅含微量苦楝素或測不出的結(jié)論不一致。陳羨德[14]對苦楝不同部位苦楝素的含量進行測定，結(jié)果顯示苦楝素的平均含量大小依次為果實>樹皮>枝葉，而本試驗的結(jié)果是苦楝素含量順序為根皮>莖皮>果實>果梗>葉片>葉柄，其中最大值為根皮2.305μg/mg，是最小值葉柄含量的5.08倍。

在實際生產(chǎn)經(jīng)營過程中，矮林作業(yè)和果林經(jīng)營是苦楝素原料林建設常見的2種模式?？嚅妊磕芰姡厣喜糠稚L快，采收方便，且參試苦楝莖皮中苦楝素含量較高，葉片、葉柄等部位也含有苦楝素，經(jīng)分析初步認為7號、9號、12號和14號供試苦楝單株適合用于矮林作業(yè)。果林經(jīng)營不破壞樹體，對植株生長有利，且經(jīng)過合理施肥和修剪等措施提高單株果實產(chǎn)量，可為苦楝的綜合利用再添新途徑，結(jié)合前述分析，可初步認為2號、5號、9號、12號、14號和15號供試苦楝單株可作為果林經(jīng)營的備選單株。

本試驗參試苦楝均為經(jīng)過篩選的具有較強生長勢的優(yōu)良單株，因此，再以其各部位苦楝素含量作為進一步選擇的指標，具有一定的生產(chǎn)應用價值。但本試驗僅是針對現(xiàn)有資源進行的初步測定和篩選，且單位面積苦楝素產(chǎn)量既與苦楝相關(guān)部位苦楝素含量有關(guān)，也與其干物質(zhì)產(chǎn)量等密切相關(guān)。因此，擴大篩選范圍，深入研究不同模式下的栽培管理技術(shù)，努力提高單位面積產(chǎn)量也是今后需要深入研究的內(nèi)容。

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第42卷第5期江 蘇 林 業(yè) 科 技Vol.42No.52015年10月JournalofJiangsuForestryScience&TechnologyOct.2015