史忠良　(淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校,江蘇淮安 223200)

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辣椒青枯病生防菌的分離和鑒定

史忠良(淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校,江蘇淮安 223200)

辣椒青枯病是由青枯雷爾氏菌引起的一種以土壤傳播為主的細(xì)菌性病害[1]。目前對(duì)該病的防治主要以化學(xué)手段為主，但長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性和造成環(huán)境污染，因此，生物防治受到國內(nèi)外研究者的廣泛重視[2]。目前已在多種作物體內(nèi)分離篩選到具有抗菌活性并對(duì)青枯雷爾氏菌有較好抑制效果的內(nèi)生細(xì)菌[3]。然而關(guān)于辣椒青枯病內(nèi)生拮抗菌篩選的報(bào)道較少[4]。筆者從辣椒青枯病發(fā)病區(qū)健康辣椒植株體內(nèi)篩選出1株對(duì)辣椒青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)該抗生菌進(jìn)行了鑒定，旨在為辣椒青枯病的防治提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。辣椒青枯雷爾氏菌(R.solanacearumC3)由淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2培養(yǎng)基。分離篩選用YGPA培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，瓊脂18 g，H2O 1 000 ml，pH 7.2。

1.1.3試劑。試驗(yàn)用試劑均為優(yōu)級(jí)純，用于高效液相色譜分析的為色譜純。

1.2方法

1.2.1生防菌的分離。取辣椒植株用自來水沖洗，再用滅菌水沖洗干凈，將表面水分用滅菌濾紙吸干，用無菌刀除去莖桿表皮，切取黃豆粒大小的組織塊(木質(zhì)部)，在75%乙醇中浸泡1 min，然后用0.1%氯化汞消毒2 min，用滅菌水沖洗3次，加入10 ml無菌水于滅菌的研缽中研磨，靜置30 min左右，在YGPA培養(yǎng)基平板上涂抹浸出液0.1 ml，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，以滅菌水沖洗消毒后組織用的第3次沖洗液作為對(duì)照，若對(duì)照中無菌落，在研磨液中長出菌落是內(nèi)生細(xì)菌。

1.2.2生防菌的純化。在分離平板長出單菌落后，挑取形態(tài)不同的單菌落重新于YGPA培養(yǎng)基平板上劃線純化，置于28～30 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)48 h，挑取單菌落編號(hào)后用YGPA斜面培養(yǎng)基4 ℃保存。

1.2.3生防菌的篩選。采用點(diǎn)接法篩選分離得到的菌株。在YGPA培養(yǎng)基平板上涂布培養(yǎng)18 h的濃度為1×108cfu/ml的青枯雷爾氏菌病原菌懸液0.1 ml，然后用無菌牙簽在每個(gè)平板上均勻接種4個(gè)參試菌株，3個(gè)重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定其抑菌圈直徑。

1.2.4生防菌拮抗效能的測定。采用牛津杯平板擴(kuò)散法(雙層營養(yǎng)瓊脂)。將平板底層倒一薄層YGPA固體培養(yǎng)基凝固后，每個(gè)平板放置3個(gè)滅菌牛津杯，然后將YGPA培養(yǎng)基與培養(yǎng)48 h的青枯雷爾氏菌(菌液濃度為1×108cfu/ml)混合，凝固后將牛津杯取出，然后取搖床培養(yǎng)18 h(28 ℃，200 r/min)的拮抗菌培養(yǎng)液0.2 ml加入每個(gè)孔中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，測定拮抗效能，3次重復(fù)。

1.2.5生防菌的鑒定。

1.2.5.1菌落形態(tài)觀察。將內(nèi)生細(xì)菌接種在YGPA培養(yǎng)基平板上， 1～2 d后觀察菌落形態(tài)、菌落的邊緣及菌落的高度。

1.2.5.2革蘭氏染色。YGPA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)18 h內(nèi)取一環(huán)置于載玻片上，涂成均勻薄層，微火固定后，滴加1～2滴草酸銨結(jié)晶紫覆蓋涂片處，染色1 min，水洗，加碘液染1 min，水洗，用95%乙醇脫色后，再滴番紅染液復(fù)染1 min，水洗，濾紙吸干后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的著色情況；觀察菌體形態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生菌的分離與篩選從健康辣椒植株體內(nèi)共分離到35株內(nèi)生菌株，經(jīng)室內(nèi)平板拮抗試驗(yàn)，得到8株拮抗細(xì)菌(表1)。其中，CQW菌株對(duì)辣椒青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)的抗菌活性，抑菌圈直徑接近16 mm。因此，選用CQW菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1　內(nèi)生菌對(duì)青枯雷爾氏菌的拮抗作用

2.2CQW菌株的鑒定

2.2.1培養(yǎng)特征。革蘭氏陽性(G+)(圖1)，短桿狀，大小為(0.6～0.8)μm×(2.1～2.5)μm(圖2)，產(chǎn)芽孢。

2.2.2菌體形態(tài)。在YGPA培養(yǎng)基上呈白色半透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規(guī)則(圖3)。

2.2.316S rDNA基因序列測定與分析。以CQW菌株基因組DNA為模板，用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，測得16S rDNA 擴(kuò)增片段長度為1 458 bp。使用Blastn程序進(jìn)行比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，表明CQW菌株與Bacillusspp.聚為一類，且與Bacilluscereus菌株親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)100%，結(jié)合CQW 菌株的形態(tài)特征，確定CQW菌株為芽孢桿菌屬的蠟樣芽孢桿菌(B.cereusCQW)，登記號(hào)為KF016033。

3結(jié)論與討論

該研究驗(yàn)從辣椒健康植株體內(nèi)分離到35株菌株，其中8株優(yōu)良菌株對(duì)辣椒青枯病有抑菌作用，根據(jù)內(nèi)生菌對(duì)病原菌拮抗能力的差異篩選得出CQW菌株，發(fā)現(xiàn)CQW菌株產(chǎn)生的抗菌活性最強(qiáng)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。通過形態(tài)鑒定和16S rDNA初步確定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

辣椒青枯病的發(fā)生越來越普遍和嚴(yán)重，已引起許多研究者的高度重視。植物內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害是一個(gè)新興的領(lǐng)域，它們的存在對(duì)于加強(qiáng)植物適應(yīng)環(huán)境具有重要意義[5]。某些內(nèi)生細(xì)菌不僅能夠抑制病原菌的生長，而且能夠促進(jìn)寄主的生長，它們既可以作為生物防治劑也可以作為植物促生劑應(yīng)用于生產(chǎn)[6]。該試驗(yàn)結(jié)果可為辣椒青枯病的防治提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] HAYWARD A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused byPseudomonassolanacearum[J]. Annu Rev Phytopatho1, 1991, 29: 65-87.

[2] 張海利，陳永兵，徐堅(jiān).番茄青枯病生物防治研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2008(8): 98-101.

[3] 易有金，劉如石，尹華群，等.煙草青枯病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分離、鑒定及其田間防效[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18(3): 554-558.

[4] 陳敏，許麗君，吳斌娟，等.黃瓜青枯病內(nèi)生拮抗菌株HE-1的初步鑒定及培養(yǎng)優(yōu)化條件[J].科技通報(bào)，2008，24(4): 489-493.

[5] 彭細(xì)橋，周國生，鄧正平，等.煙草青枯病內(nèi)生拮抗菌的篩選、鑒定及其防效測定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37(6): 670-674.

[6] 袁軍，孫福在.防治馬鈴薯環(huán)腐病有益內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選[J].微生物學(xué)報(bào)，2002，42(3): 270-274.

摘要[目的]篩選辣椒青枯病內(nèi)生拮抗菌，為辣椒青枯病防治提供參考。[方法]通過生防菌拮抗效能的測定從辣椒青枯病發(fā)病區(qū)健康辣椒植株體內(nèi)分離對(duì)辣椒青枯雷爾氏菌(R.solanacearum)有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，并通過形態(tài)鑒定、16S rDNA同源性序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]從辣椒青枯病發(fā)病區(qū)健康植株體內(nèi)分離篩選到1株對(duì)辣椒青枯病有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌CQW菌株，初步鑒定其為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。[結(jié)論]為辣椒青枯病防治提供了資源菌。

關(guān)鍵詞辣椒青枯病；生防菌；分離；鑒定

Separation and Identification of Biocontrol Bacteria against Pepper Bacterial Wilt

SHI Zhong-liang(Huai’an Bioengineering Higher Vocational School，Huai’an，Jiangsu 223200)

Abstract[Objective] Biocontrol bacteria against pepper bacterial wilt were screened out to provide reference for controlling the disease.[Method] Some biocontrol bacteria against R.solanacearum were separated from healthy pepper plants in diseased area of pepper bacterial wilt，and then identified through morphological identification and 16S rDNA homologous sequence analysis.[Result] Biocontrol bacteria CQW was obtained and identified as Bacillus cereus.[Conclusion] The research provides new resource for controlling pepper bacterial wilt.

Key wordsPepper bacterial wilt; Biocontrol bacteria; Separation; Identification

收稿日期2015-04-30

作者簡介史忠良(1976- )，男，江蘇淮安人，講師，從事農(nóng)業(yè)資源利用研究。

中圖分類號(hào)S 432.4+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)18-128-02