張 俊， 潘 易， 林寶達(dá)， 周春何， 董海潔

(1.麗水市環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江麗水 323000;2.麗水市固體廢物管理中心，浙江麗水 323000)

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多孔菌漆酶在AOT/異辛烷反膠團(tuán)中的特性表征

張 俊1， 潘 易2， 林寶達(dá)1， 周春何1， 董海潔1

(1.麗水市環(huán)境監(jiān)測中心站, 浙江麗水 323000;2.麗水市固體廢物管理中心，浙江麗水 323000)

多孔菌漆酶對降解含氯有機(jī)物的作用是非常明顯的，但因其在水相中穩(wěn)定性不高，因而限制了它的廣泛使用。為了增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，克服在溶解狀態(tài)易受抑制的缺點(diǎn)，通常采用吸附法[1-3]、交聯(lián)法[4-6]、共價(jià)鍵結(jié)合法[7-9]和包埋法固定化酶[10-12]。與傳統(tǒng)固定化方法相比，反膠團(tuán)包埋酶技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。反膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征使酶在有機(jī)溶劑中溶入很小的水環(huán)境中，由于表面活性劑的存在而使酶不與有機(jī)溶劑直接接觸，可更好地保護(hù)酶的催化活性部位，因而活性和穩(wěn)定性得到保留。筆者研究了多孔菌漆酶在二-(2-乙基己基)琥珀酸雙酯磺酸鈉(AOT)∕異辛烷反膠團(tuán)中的穩(wěn)定性，并與相應(yīng)的游離漆酶進(jìn)行比較。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料多孔菌菌種，中科院化學(xué)研究所提供；鄰聯(lián)甲苯胺，分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠；AOT氣溶膠，浙江嘉善巨楓化工廠；756 MC型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)化器有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1游離漆酶活性的測定。取0.1 mol/L 、pH 4.6的醋酸緩沖液3.4 ml，加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺0.5 ml，再加入游離漆酶液0.1 ml，25 ℃保溫30 min。在756 MC型紫外可見分光光度計(jì)下測定600 nm處的光密度(OD值)，以空白不含酶溶液為對照。酶活力以酶與底物反應(yīng)30 min后光密度的改變值表示。以每分鐘光密度增加0.01為1個(gè)酶活力單位。

1.2.2反膠團(tuán)的制備。在含0.1 mol/L AOT的異辛烷溶液中加入一定量的0.02 mol/L、pH 4.6的漆酶醋酸鹽緩沖液(其中加入游離漆酶液)，立即振蕩溶液至澄清，使之形成均一、透明、穩(wěn)定的反膠團(tuán)體系，即得所需含水值為R的含酶反膠團(tuán)。欲改變R值，只需調(diào)節(jié)注入的緩沖液量即可。R值的定義為有機(jī)相中水的摩爾濃度與AOT摩爾濃度之比，即R=[H2O]/[AOT]。

1.2.3反膠團(tuán)酶活力的測定。取5 ml漆酶反膠團(tuán)(其中含游離漆酶0.1 ml)，加入0.1 mol/L、pH 4.6的醋酸鹽緩沖液3.4 ml，再加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺0.5 ml，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)25 min后，在25 ℃下4 000 r/min的離心機(jī)上離心5 min。取下清液，放在756 MC型紫外可見分光光度計(jì)測600 nm處的光密度(OD值)，以與空白不含酶的為對照。酶活力以漆酶反膠團(tuán)與底物反應(yīng)30 min后光密度的改變值表示。以每分鐘光密度增加0.01為1個(gè)酶活力單位。

1.3數(shù)據(jù)分析方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 8.01版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理和分析。采用DMRT法進(jìn)行多重比較，P值均為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1反膠團(tuán)中不同含水值及Tween-80濃度對漆酶反膠團(tuán)活力的影響反膠團(tuán)的含水值是反膠團(tuán)結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)之一。它會影響漆酶反膠團(tuán)活力。Tween-80作為一種助表面活性劑，在反膠團(tuán)中的濃度也會影響漆酶反膠團(tuán)活力。表1表明，反膠團(tuán)中不同含水值和Tween-80濃度對漆酶反膠團(tuán)活力都有顯著影響。當(dāng)反膠團(tuán)中Tween-80濃度為0.012 5 mol/L時(shí)，漆酶反膠團(tuán)活力提高最顯著，當(dāng)含水值為30時(shí)漆酶反膠團(tuán)活力達(dá)到51.97，是未加Tween-80時(shí)活力的1.43倍，是游離漆酶活力的1.40倍。這一結(jié)果與前人研究報(bào)道的關(guān)于漆酶在反膠團(tuán)體系下體現(xiàn)出“超活力”的結(jié)論[13]一致。

表1　不同含水值和Tween-80濃度對漆酶反膠團(tuán)活力的影響　U

注：采用DMRT法進(jìn)行多重比較，同列數(shù)據(jù)中含有相同字母者表示差異不顯著；括號里的字母是同行多重比較結(jié)果，含有相同字母者表示差異不顯著。

2.2制備反膠團(tuán)時(shí)加入不同pH緩沖液對漆酶反膠團(tuán)活力的影響由圖1可知，加入的緩沖液pH在4.2～5.0之間對漆酶反膠團(tuán)活力影響不顯著，且活力都維持在較高水平。加入緩沖液的最適pH為4.6，此時(shí)漆酶反膠團(tuán)活力為51.97，加入緩沖液的最適pH與“1.2.2”漆酶反膠團(tuán)的制備方法中加入的緩沖液pH相同。

2.3溫度對漆酶反膠團(tuán)活力的影響由圖2可知，漆酶反膠團(tuán)在22～38 ℃之間時(shí)活力受溫度影響不顯著，且活力都維持在較高水平。當(dāng)漆酶反膠團(tuán)最適作用溫度為30～36 ℃時(shí)，活力達(dá)到53.70 U。與游離漆酶相比，漆酶反膠團(tuán)在20～40 ℃的活力變化更小，最適作用溫度有所提高。這反映漆酶反膠團(tuán)的熱穩(wěn)定性較游離漆酶得到提高。郭從容等[14]對青霉素酰胺酶經(jīng)反膠團(tuán)包埋后最適作用溫度提高5 ℃的報(bào)道與該試驗(yàn)結(jié)果接近。

2.4pH對漆酶反膠團(tuán)活力的影響由圖3可知，漆酶反膠團(tuán)在pH 3.5～5.3之間時(shí)活力變化不顯著，且都維持在較高水平。在此pH范圍之外，活力都會有所下降，在漆酶反膠團(tuán)最適作用pH 4.4～4.7時(shí)，活力達(dá)到51.97 U。

2.5漆酶反膠團(tuán)的熱穩(wěn)定性由圖4可知，漆酶反膠團(tuán)在30、40、50 ℃保存4 d后活力變化顯著；30、40、50 ℃保存30 d活力分別保留84.4%、81.3%、62.0%。而游離漆酶在30、40、50 ℃保存30 d活力，分別只保留69.4%、10.5%、6.2%。與游離漆酶液相比，漆酶反膠團(tuán)熱穩(wěn)定性得到顯著提高。

2.6漆酶反膠團(tuán)的酸堿穩(wěn)定性由圖5可知，漆酶反膠團(tuán)在pH 4.0～5.0下保存較穩(wěn)定，pH 4.5時(shí)保存最穩(wěn)定，保存30 d活力僅損失10.4%；pH 5.0時(shí)保存30 d,活力保留66.3%；但，在pH小于3.0或大于5.5時(shí)保存不穩(wěn)定，在pH 3.0保存30 d，活力僅保留42.5%；pH 6.0時(shí)保存30 d，活力僅保留21.0%。與游離漆酶相比，pH 4.5時(shí)保存30 d，活力僅保留45.0%；pH 5.0時(shí)保存30 d，活力保留20.4%；pH 5.5時(shí)保存30 d，活力僅保留13.1%，漆酶反膠團(tuán)的酸堿穩(wěn)定性也得到顯著提高。

3結(jié)論與討論

(1)經(jīng)反膠團(tuán)包埋后，漆酶的穩(wěn)定性較游離漆酶有較大提高，熱失活和酸堿失活顯著減少。這可能是因?yàn)槊冈诜茨z團(tuán)內(nèi)的微環(huán)境比在水溶液中更接近其天然的胞內(nèi)環(huán)境，有利于維持具有催化功能的酶的空間構(gòu)象，減少其他構(gòu)象的存在[15]，從而保持較高的酶活性。另一方面，酶的穩(wěn)定性一般與水化程度有關(guān)，不完全水化的酶的穩(wěn)定性往往較高[16]，因此反膠團(tuán)體系中有機(jī)溶劑的存在也有利于改善酶的穩(wěn)定性。

(2)反膠團(tuán)體系中不同含水值、Tween-80濃度以及制備反膠團(tuán)時(shí)加入不同pH的緩沖液對漆酶反膠團(tuán)活力都有一定影響。當(dāng)反膠團(tuán)體系中含水值為30、Tween-80濃度為0.012 5 mol/L、制備反膠團(tuán)的緩沖液pH為4.6時(shí)，制得的反膠團(tuán)酶活力最高。該酶在AOT/異辛烷反膠團(tuán)體系中的最適作用溫度為30～36 ℃，最適作用pH為4.4～4.7。該條件下反膠團(tuán)體系較穩(wěn)定。

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摘要[目的]對多孔菌漆酶包埋于AOT/異辛烷反膠團(tuán)中的特性進(jìn)行研究。[方法]在漆酶反膠團(tuán)中加入醋酸鹽緩沖液和鄰聯(lián)甲苯胺，放入25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)25 min后離心，取下清液，測光密度值。[結(jié)果]在漆酶反膠團(tuán)體系中加入適量吐溫-80后，漆酶反膠團(tuán)酶活力有所提高。經(jīng)反膠團(tuán)包埋后，酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較水相酶有較大提高，在40 ℃下保溫30 d酶活力保留81.3%，在pH 4.5下保存30 d酶活力保留89.6%。[結(jié)論]在該反膠團(tuán)體系中, 酶的穩(wěn)定性有較大的提高。

關(guān)鍵詞多孔菌漆酶；AOT；異辛烷；反膠團(tuán)；特性表征

Characterization of Polyporous Laccase in AOT/Isooctane Reversed Micelles

ZHANG Jun1，PAN Yi2，LIN Bao-da1et al(1.Lishui Environmental Monitoring Center, Lishui, Zhejiang 323000; 2. Lishui Solid Waste Management Center, Lishui, Zhejiang 323000)

Abstract[Objective] The characteristics of polyporous laccase entrapped in AOT/isooctane reversed micelles were studied. [Method] Acetate buffer and o-tolidine into AOT/isooctane reversed micelles was added, then was put in an incubator chamber at 25 degrees for 25 minutes. Bottom clear liquid was collected to measure optical density value after centrifugating. [Result] Its activity was enhanced after joining optimal quantity of Tween-80 and its stability to variation of temperature and pH was improved to a great extent. 81.3% of its activity still remained after storage at 40 ℃ for 30 days,and 89.6% of its activity remained after storage at pH 4.5 for 30 days. [Conclusion] The stability of polyporous laccase was enhanced greatly in the reversed micelles.

Key wordsPolyporous laccase; AOT; Isooctane; Reversed micelles; Characterization

收稿日期2015-04-30

作者簡介張俊(1980- )，男，浙江杭州人，工程師，碩士，從事環(huán)境樣品檢測方面的研究。

中圖分類號S -03

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2015)18-005-03