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        MRFs家族基因在鯉魚紅肌和白肌中的表達差異

        2016-01-27 14:34:20張明呂明李瑞文等
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2015年11期
        關(guān)鍵詞:腹肌

        張明 呂明 李瑞文等

        摘要:為探索生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulator factors,MRFs)家族基因在鯉魚肌纖維形成中的基本作用,利用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測MRFs家族各成員在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異,并與紅肌纖維的標志基因MyHCⅠ及白肌纖維的標志基因MyHCⅡ的表達水平進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明,MyoD基因在鯉紅肌中的表達極顯著高于在白肌中的表達,并與MyHCⅠ基因的表達呈顯著正相關(guān),Myf6在鯉魚白肌中的表達極顯著高于其在紅肌中的表達水平,并與MyHCⅡ基因的表達呈顯著正相關(guān),Myf5、MyoG在鯉魚紅肌、白肌中的表達水平差異不顯著。

        關(guān)鍵詞:MRFs家族基因;紅??;背??;腹?。货?/p>

        中圖分類號: S917文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2015)11-0049-02

        收稿日期:2014-11-26

        基金項目:國家自然科學基金(編號:31201990);四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(編號:2014JY0088);西南民族大學國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(編號:X201410656057)。

        作者簡介:張明(1988—),男,重慶人,從事生物技術(shù)研究。E-mail:zhangmingcoming@163.com。

        通信作者:林亞秋,副教授,從事動物肉質(zhì)調(diào)控研究。 E-mail:linyq1999@163.com。肌纖維類型及其組成對動物肉品質(zhì)具有重要影響,肌纖維類型主要包括兩大類:Ⅰ型(紅肌、慢?。ⅱ蛐停ò准?、快肌)肌纖維。不同類型肌纖維特性不同(如收縮功能、線粒體成分、代謝特性等),進而導致肌肉品質(zhì)存在差別[1-2]。研究表明,若肌肉中紅肌纖維比例高于白肌纖維,則肌肉的品質(zhì)較好[3-4]。Toniolo等將肌球蛋白重鏈 (myosin heavy chain,MyHC) 基因的同工型作為肌纖維類型的分子標志[5]。生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulator factors,MRFs) 家族基因在動物肌纖維的形成、分化中具有重要的調(diào)控作用,該家族編碼MyoD1、Myf5、MyoG、Myf6等4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子具有不同的時空表達特性[6-8]。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)分析生肌調(diào)節(jié)因子家族MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6基因在鯉魚紅肌、白?。ū臣?、腹?。┲械谋磉_差異,并與紅肌、白肌纖維標志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的表達水平進行關(guān)聯(lián)分析,初步確定該家族基因在鯉魚肌纖維形成中的作用,旨在為通過肌纖維類型調(diào)控魚類肉質(zhì)提供依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1樣品的采集

        所用鯉魚購自西北農(nóng)林科技大學安康水產(chǎn)試驗示范站。選擇體質(zhì)量為500 g左右的成年鯉魚6尾,致死后迅速取其背部紅肌、背肌、腹肌組織,用錫箔紙包好,置于-80 ℃冰箱中備用。

        1.2主要試劑

        TRIzol總RNA提取試劑盒與SYBRPremix Ex TaqTM (2×)均購自大連TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶均購自Fermentas公司;DEPC原液由Sigma公司分裝。

        1.3方法

        1.3.1鯉魚紅肌、白肌組織總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄取出備用的鯉魚紅肌、白肌組織,按照TRIzol試劑盒說明書的方法提取肌肉組織的RNA,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,同時利用紫外分光光度計測定RNA的濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的方法,取1 g總RNA,以O(shè)ligo (dT) 為引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

        1.3.2引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上登陸的β-actin、MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ序列(表1),利用Primier 5.0軟件設(shè)計這些基因的特異引物用來擴增在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異。

        1.3.3實時熒光定量PCR利用熒光定量PCR檢測MyoD、Myf5、MyoG 、Myf6、MyHCⅠ、MyHCⅡ基因在鯉紅肌、白肌中的表達水平。總反應(yīng)體系為20 μL,其中SYBRPremix Ex TaqTM (2×)PCR 10 μL,模板cDNA 1 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,57.6~62.3 ℃退火30 s,45個循環(huán);72 ℃延伸30 s。

        1.3.4數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù),所得數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示,采用ANOVA進行差異性顯著檢驗分析。熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCT 方法進行分析[9]。

        2結(jié)果與分析

        2.1MyoD、Myf5、MyoG、Myf6基因在鯉魚紅肌、白肌中的表達差異

        熒光定量檢測MRFs家族基因在鯉魚紅肌、背肌、腹肌中的表達結(jié)果(圖1至圖4)顯示,MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平極顯著高于在背肌、腹肌中的表達水平。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達水平極顯著高于其在紅肌中的表達水平。Myf5、MyoG基因在鯉魚紅肌與背肌、腹肌中的表達水平差異不顯著。

        2.2MRFs家族基因與肌纖維標志基因MyHCⅠ、MyHCⅡ的相關(guān)性

        MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平與MyHCⅠ基因的表1基因特異引物序列

        基因名稱特異引物序列退火溫度表達呈極顯著正相關(guān)(r=0.908,P<0.01),Myf6在鯉魚白肌中的表達水平與MyHCⅡ基因的表達呈極顯著正相關(guān)(r=1.000,P<0.01)。

        3結(jié)論與討論

        MRFs家族基因都具有典型的堿性螺旋環(huán)結(jié)構(gòu),控制著動物肌肉發(fā)育的整個過程(包括成肌細胞的增殖、分化和肌纖維的形成),是動物肌肉發(fā)育過程中重要的正向調(diào)控因子。因此研究其在魚類肌纖維形成中的作用具有重要意義。MRFs家族基因在哺乳動物、魚類中的組織分布不同,在哺乳動物中僅在肌肉組織中表達[10-11],在魚類多種組織中均存在表達,但主要分布在肌肉組織中[12-14]。生肌調(diào)節(jié)因子在紅肌、白肌中表達水平的差異對2種肌肉的肌纖維形成、肌肉生長率有影響。本研究結(jié)果表明,MyoD基因在鯉魚紅肌中的表達水平極顯著高于其在白?。ū臣 ⒏辜。┲械谋磉_水平,并與紅肌纖維的標志基因呈顯著正相關(guān)。Myf6基因在鯉魚背肌、腹肌中的表達水平極顯著高于其在紅肌中的表達水平,并與白肌纖維的標志基因呈顯著正相關(guān)。MyoG、Myf5基因在鯉魚紅肌中的表達水平與在背肌和腹肌中的表達水平差異不顯著,可見MyoD可能在鯉魚的紅肌纖維形成中發(fā)揮主要作用,Myf6基因可能在鯉魚的白肌纖維形成中發(fā)揮主要作用。MyoD在嚙齒動物的白肌中表達量較高,Myogenin卻表達量較低[15],這與本試驗結(jié)果不同,可能具有物種特異性。

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