于曉，戴衍朋

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 ; 2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

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蜜炙對升麻有機(jī)酸類成分的影響

于曉1，戴衍朋2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 ; 2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：建立了HPLC法同時測定升麻中咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸3種成分的方法，并考察蜜炙對升麻中有機(jī)酸成分的影響。應(yīng)用Thermo AcclaimTM120 C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，在流速1 mL/min、柱溫為30 ℃及檢測波長316 nm的條件下，以乙腈-0.1%磷酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明，咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸分別在0～0.028 μg(R=0.999 5)、0～0.067 μg(R=0.999 4)和0～0.27 μg(R=0.999 9)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,加樣回收率分別為99.8%、99.4%和101.6%。該方法簡便、可靠且準(zhǔn)確，可用于證明蜜炙對升麻中3種有機(jī)酸成分具有一定的影響。

關(guān)鍵詞：升麻； 蜜炙； 咖啡酸； 阿魏酸； 異阿魏酸

升麻來源于毛茛科植物大三葉升麻(CimicifugaheracleifoliaKom.)、興安升麻(Cimicifugadahurica(Turcz.) Maxim .)或升麻(CimicifugafoetidaL.)的干燥根莖。其主要功效是清熱解毒、發(fā)表透疹和升舉陽氣，臨床上主要用于治療風(fēng)熱頭痛、齒痛、口瘡、咽喉腫痛、麻疹不透以及陽毒發(fā)斑等癥[1]。升麻主要有升麻片、蜜升麻和升麻炭3種炮制規(guī)格[2]。升麻經(jīng)蜜炙后減弱了其辛散作用，略帶甘補(bǔ)之性，以升舉脾陽為主，同時對胃的刺激性減輕，主要用于中氣虛弱、短氣乏力、倦怠以及中氣下陷之久痢、久瀉、脫肛、子宮下垂以及崩漏等[3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)升麻具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理活性[4]。曹麗等[5]通過小鼠福爾馬林致痛反應(yīng)、熱板法、醋酸扭體實驗和小鼠自發(fā)活動及舉雙肢法，發(fā)現(xiàn)不同品種的升麻經(jīng)過蜜炙后鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜活性顯著增強(qiáng)。Ou等[6]對阿魏酸進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)阿魏酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。劉蓓蓓等[7]提到升麻根莖中所含的一類酚酸性物質(zhì)(如阿魏酸、異阿魏酸)具有較強(qiáng)的抗炎作用。升麻蜜炙后功效的變化與其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)變化相關(guān)，本文采用HPLC法測定了升麻和蜜升麻中的有效成分咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的含量，并初步探討了蜜炙對3種有機(jī)酸成分的影響，為升麻蜜炙的炮制原理研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1儀器與試藥

1.1儀器

Sartorius R200D十萬分之一電子天平(德國賽多利斯集團(tuán))，Thermo U3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2試藥

升麻樣品由山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒定均為大三葉升麻干燥根莖的加工品。蜜升麻樣品由升麻樣品采用文獻(xiàn)[4]方法炮制加工即得?？Х人?K-003-110523)購于四川瑞芬思生物科技有限公司，阿魏酸(110773-201012)和異阿魏酸(11698-200602)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純(迪馬科技)；甲醇、磷酸均為分析純(天津富宇)；水為自制超純水。

2實驗方法和結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTM120 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相： A為乙腈，B為0.1%磷酸水，梯度洗脫程序為0～15 min，12%～20% A；15～30 min，20%～26% A。流速為0.8 mL/min，柱溫為30 ℃，波長為320 nm，進(jìn)樣量為5 μL。按照上述色譜條件進(jìn)樣，對照品和供試品的色譜圖如圖1～2所示。

A 咖啡酸 B阿魏酸 C異阿魏酸圖1　混合對照品色譜圖Fig.1　Chromatogram of the compound reference substance

A 咖啡酸 B阿魏酸 C異阿魏酸圖2　升麻飲片樣品色譜圖Fig.2　Chromatogram of Cimicifugae Rhizomas amples

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備

分別取咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸對照品適量，精密稱定，加10%甲醇溶解定容，制得含咖啡酸0.356 mg/mL、阿魏酸0.133 mg/mL和異阿魏酸0.133 mg/mL的對照品儲備液；分別精密吸取咖啡酸儲備液0.4 mL、阿魏酸、異阿魏酸儲備液1 mL至10 mL容量瓶中，加10%甲醇定容，得到3種有機(jī)酸的混合溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

精密稱取升麻及蜜升麻飲片粉末(過二號篩)0.2 g，加入20 mL10%的甲醇，稱定重量后加熱回流提取1.5 h，放冷后再次稱定重量，減失的重量用10%甲醇補(bǔ)足，搖勻，過濾，即得[8]。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系

取濃度為2.848 、6.650、26.600 μg/mL的咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸對照品溶液，分別進(jìn)樣1、3、5、8、10、12 μL，測定各自峰面積，以進(jìn)樣量(μg)、峰面積分別為橫坐標(biāo)(X)、縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見表1。

表1　3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.2精密度實驗

精密吸取5μL咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測定咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的峰面積，結(jié)果3種成分峰面積的RSD分別為0.55%、0.38%、0.24%，表明本方法精密度符合要求。

2.3.3重復(fù)性實驗

取5份同一批次的升麻樣品，按照2.2.2項下的方法制備供試品溶液，然后按2.1項下的色譜條件進(jìn)行色譜分析，分別測定3種有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸平均含量分別為0.030%、0.081%和0.430%，平均含量的RSD分別為1.5%、2.3%和2.0%，表明該實驗方法的重復(fù)性符合HPLC色譜技術(shù)要求。

2.3.4穩(wěn)定性實驗

精密吸取同一供試品溶液5μL，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，結(jié)果咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸峰面積的RSD分別為0.79%、1.35%和0.75%，表明在24h內(nèi)3種有機(jī)酸成分穩(wěn)定性良好。

2.3.5加樣回收率實驗

取9批已知有機(jī)酸含量的升麻樣品粉末，分別加入樣品含量80%、100%、120%的咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的對照品溶液，按2.2.2項下的方法制備，測定3種有機(jī)酸成分的含量，并計算各自回收率，結(jié)果見表2。

2.4樣品測定

按2.2.2項下供試品溶液的制備方法和色譜條件對所有升麻飲片及相應(yīng)的蜜升麻飲片樣品進(jìn)行測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表2　加樣回收率實驗結(jié)果

表3　測定結(jié)果(%，n=3)

3討論

由于有機(jī)酸化合物的極性偏大，本課題組比較了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇(O、10%、20%、30%、40%、50%)和不同回流時間(1、1.5、2、2.5、3 h)的提取效果，發(fā)現(xiàn)以10%甲醇為溶劑超聲提取1.5 h最佳。

異阿魏酸是中國藥典2010年版中升麻藥材的含量測定指標(biāo)，在升麻中的含量遠(yuǎn)高于咖啡酸和阿魏酸；蜜炙后咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸含量均有所升高，這種變化與蜜炙后功效改變的關(guān)系尚需進(jìn)一步結(jié)合藥效學(xué)實驗進(jìn)行深入研究。實驗結(jié)果可以為升麻蜜炙的原理研究提供數(shù)據(jù)支持。

本實驗建立了升麻中咖啡酸、阿魏酸和異阿魏酸的含量測定方法，實驗所確定的方法簡便、準(zhǔn)確，可用于升麻及升麻飲片的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 曹麗,孫紅,李展,等.不同品種的升麻蜜制前后藥理活性的比較[J].中藥材,2007,30(12):1561-1563.

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[8] 張慧芳,戴衍朋.正交試驗設(shè)計優(yōu)選升麻最佳蜜制工藝[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2014,34(7):520-523.

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

Impact of honey-fired processing on organic acid

components in Cimicifugae Rhizoma

YU Xiao1,DAI Yan-peng2

(1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;

2.Shandong Academy of Chinese Medicine,Jinan 250014,China)

Abstract∶We develop a determination method for cafeic acid,ferulic acid, isoferulic acid in Cimicifugae Rhizoma with HPLC and address the impact of honey-fired processing on organic acid in Cimicifugae Rhizoma.We employed Thermo AcclaimTM120 C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)to perform gradient elution with acetonitrile-0.1%phos-phoric acid as mobile phase, flow rate of 1.0 mL/min, column temperature of 25 ℃, and detection wavelength of 316 nm.Results show that better linear relationship exists in 0～0.028 μg for cafeic acid(R=0.999 5), 0～0.067 μg for ferulic acid(R=0.999 4)and 0～0.27 μg for isoferulic acid(R=0.999 9).Their recovery rates are 99.8%,99.4% and 101.6%.The method is simple,reliable and accurate and can be used for proving some influences of honey-fired processing on the three organic acid in Cimicifugae Rhizoma.

Key words∶Cimicifugae Rhizoma; honey-fired processing;cafeic acid;ferulic acid;isoferulic acid

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.006

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026(2015)04-0025-05

通訊作者*，戴衍朋，男，碩士，助理研究員，研究方向為中藥炮制及分析。Email：daiyanpeng@gmail.com

作者簡介：于曉(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為中藥炮制及中藥化學(xué)。Email：545787679@qq.com

基金項目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃(2011-180)；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201207004-9)

收稿日期：2015-05-14