朱雙雙，王孌，馬瑞欣

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003)

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糖尿病腎病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 mRNA表達(dá)變化及意義

朱雙雙，王孌，馬瑞欣

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003)

摘要：目的觀察糖尿病腎病(DN)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞受體相互作用蛋白140(RIP140)mRNA的表達(dá)變化并探討其意義。方法65例2型糖尿病患者分為單純2型糖尿病30例(糖尿病組)和DN 35例(DN組)，另選28例健康體檢者為對(duì)照組，采用RT-PCR法檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞的RIP140、TNF-α、IL-6 mRNA。采用ELISA法測(cè)定各組血清TNF-α、IL-6。結(jié)果外周血單個(gè)核細(xì)胞中RIP140、TNF-α 、IL-6 mRNA表達(dá)及血清IL-6水平均為DN組>糖尿病組>對(duì)照組,P均<0.05；DN組和糖尿病組血清TNF-α均高于對(duì)照組(P均<0.05)，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析顯示,RIP140 mRNA表達(dá)與IL-6 mRNA(r=0.374，P=0.046)、TNF-α mRNA(r=0.505，P=0.002)、血清TNF-α水平(r=0.593，P=0.001)呈正相關(guān)。結(jié)論DN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 mRNA表達(dá)升高，其可能通過(guò)調(diào)控微炎過(guò)程參與DN的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎??；受體相互作用蛋白140；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6；外周血單個(gè)核細(xì)胞

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，研究證實(shí)DN的發(fā)病過(guò)程也是一種慢性微炎癥過(guò)程[1]。這種微炎癥狀態(tài)是機(jī)體受到各種因素刺激后，激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，導(dǎo)致TNF-α、IL-6等炎癥因子升高[1]。受體相互作用蛋白140(RIP140)是核受體輔助轉(zhuǎn)錄因子，能與NF-κB途徑共激活，調(diào)控炎癥因子的表達(dá)[2，3]。目前，RIP140在DN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中作用的相關(guān)報(bào)道臨床少見(jiàn)。2014年2月～2015年1月，我們檢測(cè)了DN患者外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 mRNA的表達(dá)，探討其在DN發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料納入標(biāo)準(zhǔn)：2型糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并各種感染、嚴(yán)重的肝臟疾病、慢性疾病、自身免疫性疾病、酮癥酸中毒及影響尿蛋白排泄的因素(如腫瘤、結(jié)核、腎臟疾病、泌尿系感染、手術(shù)、外傷等)、DN分期V期。研究對(duì)象為同期于青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2型糖尿病患者，其中男45例、女20例，年齡27～68歲，病程(8.82±7.61)年，根據(jù)Mogensen標(biāo)準(zhǔn)[4]分為單純2型糖尿病30例(糖尿病組)和DN 35例(DN組)。對(duì)照組為同期健康查體者28例，其中男19例、女9例，年齡26～59歲，無(wú)糖尿病、腎臟疾病、各種感染、慢性疾病等。各組均簽署知情同意書(shū)，一般資料具有可比性。

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞中RIP140 、TNF-α、IL-6 mRNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用TRIzol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明書(shū)合成cDNA。采用PCR Designer 軟件設(shè)計(jì)各基因引物，引物由上海瀚宇生物科技有限公司合成。引物序列：RIP140上游引物為5′-TTCTTCTCCTCCTCCTTGCGTAG-3′，下游引物為5′-GGTGCACATCAGAGCCAAGC-3′； TNF-α上游引物為5′-TCTGGGCAGGTCTACTTTGG-3′，下游引物為5′-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA-3′； IL-6上游引物為5′-CAATGAGGAGACTTGCCTGG-3′，下游引物為5′-GGCATTTGTGGTTGGGTCAG-3′；以GAPDH為內(nèi)參照。反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、1 min，95 ℃、10 s，58 ℃、20 s，72℃、30 s，循環(huán)45次。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算[5]。

1.3血清TNF-α、IL-6檢測(cè)采用ELISA法。試劑盒由上海巧伊生物科技公司及美國(guó)R&D公司提供，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)，讀取各樣本450 nm處的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及對(duì)應(yīng)的濃度為橫縱坐標(biāo)軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本檢測(cè)指標(biāo)水平。

2結(jié)果

2.1各組外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　各組外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 、TNF-α、

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與糖尿病組相比，#P<0.01。

2.2各組血清TNF-α、IL-6比較見(jiàn)表2。

表2　各組血清TNF-α、IL-6水平比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01；與糖尿病組相比，#P<0.01。

2.3RIP140 mRNA表達(dá)與炎癥因子的關(guān)系外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140 mRNA表達(dá)與IL-6 mRNA(r=0.374，P=0.046)、TNF-α mRNA(r=0.505，P=0.002)、血清TNF-α(r=0.593，P=0.001)相關(guān)，與血清IL-6(r=0.121，P=0.531)無(wú)關(guān)。

3討論

以往研究認(rèn)為，DN的發(fā)生、發(fā)展與糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、遺傳等因素有關(guān)。近年來(lái),炎癥反應(yīng)在DN中的作用逐漸受到人們的重視，特別是微炎癥反應(yīng)與慢性腎臟病變的關(guān)系。所謂的微炎癥狀態(tài)是一種由非微生物引起的、低強(qiáng)度、慢性進(jìn)展性的非顯性炎癥狀態(tài)[6]。它與微生物感染引起的炎癥不同，表現(xiàn)為患者血液中IL-6、TNF-α等單核吞噬系統(tǒng)衍生的細(xì)胞因子輕度持續(xù)增高，導(dǎo)致各種并發(fā)癥。有學(xué)者提出，慢性炎癥狀態(tài)在DN早期的發(fā)展中也起到了重要作用[7]，長(zhǎng)期的微炎癥狀態(tài)與DN的發(fā)展密切相關(guān)。IL-6是單核細(xì)胞自分泌的一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它可通過(guò)損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞的增殖和組織纖維化。TNF-α是一種細(xì)胞毒性細(xì)胞因子，能夠?qū)δI臟造成直接損傷[8～11]。

RIP140屬于核受體超家族成員，其可參與能量代謝及炎癥反應(yīng)。與RIP140在脂肪組織和肌肉組織中起輔助抑制物作用不同，在巨噬細(xì)胞中，其功能是輔助激活物，可激活炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的分泌[12]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾巨噬細(xì)胞中RIP140基因的表達(dá)能明顯抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生；RIP140對(duì)核受體NF-κB的靶基因起轉(zhuǎn)錄輔助激活作用；通過(guò)被NF-κB依賴(lài)的啟動(dòng)子募集，作為橋梁蛋白，穩(wěn)定RelA 亞基和carboyl結(jié)合蛋白共激活物，形成三聚體，激活TNF-α、IL-6等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子的分泌[13，14]。本研究中，DN組外周血單個(gè)核細(xì)胞RIP140、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平均高于糖尿病組，且RIP140 mRNA表達(dá)量與IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、血清TNF-α濃度呈正相關(guān)，提示DN的發(fā)生、發(fā)展與RIP140基因表達(dá)水平相關(guān)。但本研究尚存在研究對(duì)象入組時(shí)間不同、樣本量偏小等缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] Katheine RT. Linking metabolism and immunology: diabetic nephropathy is an inflammatory disease[J]. J Amn Soc Nep, 2005,16(6):1537-1538.

[2] Cavaillès V, Dauvois S. Nuclear factor RIP140 modulates transcriptional activation by the estrogen receptor[J]. Embo Jour, 1995,14(15):3741-3751.

[3] Zschiedrich I, Hardeland U, Krones HA, et al. Coactivator function of RIP140 for NFkappaB/RelA-dependent cytokine gene expression[J]. Blood, 2008,112(2):264-276.

[4] Mogensen CE. Microalbuminuria predicts clinical proteinuria and early mortality in maturity-onset diabetes[J]. N Engl J Med, 1984,310(6):356-601.

[5] 張艷麗,劉新風(fēng),于秀娟,等.炎癥性腸病患者腸道菌群變化及其與炎性因子的相關(guān)性[J].山東醫(yī)藥,2015,55(10):79-80.

[6] Kajitani N, Shikata K, Nakamura A, et al. Microinflammation is a common risk factor for progression of nephropathy and atherosclerosis in Japanese patients with type 2 diabetes[J]. Diabet Res Clin Pra, 2010,88(2):171-176.

[8] Navarro JF. Urinary tumour necrosis factor-alpha excretion independently correlates with clinical markers of glomerular and tubulointerstitial injury in type 2 diabetic patients[J]. Nephrol Dial Tran, 2006,21(12):3428-3434.

[9] 徐敏,楊麗華.微炎癥狀態(tài)相關(guān)因子對(duì)糖尿病腎病早期的診斷意義[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2014,31(8):1575-1577.

[10] 楊浩,姜濤,宋秀霞,等.CRP、IL-6和TNF-α與糖尿病腎病關(guān)系的研究[J].北京醫(yī)學(xué),2011,33(4):289-291.

[11] 蘇弘薇,康省,龍艷,等.糖尿病腎病與血糖波動(dòng)和炎性因子的關(guān)系探討[J].中華老年心腦血管病雜志,2015,17(3):273-276.

[12] 周雁,郭立新,于冬妮,等.1758例2型糖尿病住院患者糖尿病腎病的相關(guān)因素分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2012.33(6):610-613.

[13] 劉發(fā)林,王利榮,黃海晏,等.2型糖尿病并腎病早期相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究,2014,31(5):960-963.

[14] 李澤宇,劉棟,袁文明,等.糖尿病腎病危險(xiǎn)因素及血壓控制臨界值研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2014,17(20):2325-2328.

收稿日期：(2015-08-18)

通信作者：馬瑞欣

基金項(xiàng)目：山東省青島市民生科技計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-3-10-nsh)。

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2015)46-0044-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.018