周亞飛，　王月婷，　于嘉屏

HPLC-MS/MS同位素稀釋法測定人體血清中類固醇激素的研究

周亞飛，王月婷，于嘉屏

(上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所研發(fā)實驗室，上海 200433)

摘要：目的建立一種能同時測定血清中多種類固醇激素[包括脫氫表雄酮(DHEA)、17α-羥孕酮(17α-OHP4)、雄烯二酮(AD)、雌酮(E1)、皮質(zhì)酮(CORT)、雙氫睪酮(DHT)、孕烯醇酮(P5)和17-羥孕烯醇酮(17-OHP5)]的快速、靈敏的穩(wěn)定同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ID-HPLC-MS/MS)方法。方法血清樣品經(jīng)甲基叔丁基醚(MTBE)提取，上清液吹干后加入羥胺進(jìn)行柱前衍生化反應(yīng)后檢測。采用Phenomenex C18反相色譜柱和Phenomenex C18預(yù)保護(hù)柱。流動相A為含0.1%甲酸的水，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇。質(zhì)譜采用電噴霧電離(ESI)模式進(jìn)行離子化，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)掃描，內(nèi)標(biāo)法定量分析。結(jié)果血清中8種類固醇激素最低定量限[LLOQ，以信噪比(S/N)≥10為標(biāo)準(zhǔn)]為0.03～0.625 ng/mL；在0.05～50.00 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.998 0；批內(nèi)精密度為1.93%～13.81%，批間精密度為4.90%～16.18%，加標(biāo)回收率為80.0%～130.6%。結(jié)論建立了同時測定8種類固醇激素的ID-HPLC-MS/MS。該法靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確且高效，可在10 min內(nèi)完成分離和檢測，適用于人體血清中類固醇激素的定量分析。

關(guān)鍵詞：類固醇激素；血清；穩(wěn)定同位素稀釋；液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜

Research on the determination of serum steroid hormones by isotope dilution HPLC-MS/MSZHOUYafei，WANGYueting，YUJiaping

.(ResearchandDevelopmentLaboratory，ShanghaiDianMedicalTestingInstitute，Shanghai200433，China)

Abstract：ObjectiveTo establish a rapid, sensitive and stable isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(ID-HPLC-MS/MS) for simultaneous quantitative determination of dehydroepiandrosterone(DHEA)， 17 alpha-hydroxyprogesterone(17α-OHP4)， androstenedione(AD)， estrone(E1)， corticosterone(CORT)， dihydrotestosterone(DHT)， pregnenolone(P5)and 17-hydroxylpregnenolone(17-OHP5). MethodsThe steroid hormones were extracted from human serum by methyl tert-butyl ether(MTBE)， and the supernatant was treated with hydroxylamine to produce post-column derivatives before detection. Steroid hormones were separated by Phenomenex reversed-phase C18 with precolumn. Water containing 0.1% formic acid and methanol containing 0.1% formic acid were used as mobile phase A and B，respectively. Multiple reaction monitoring(MRM)with the positive ion detection mode was applied to selectively detect these 8 steroid hormones ionized by electrospray ionization (ESI) interface， and the quantitative analysis for them was carried out by using deuterium isotope as internal standard. ResultsThe lower limits of quantitation(LLOQ)of these 8 hormones can reach 0.03-0.625 ng/mL on the basis of signal-noise ratio (S/N) ≥10. The correlation coefficients(r)were ≥0.998 0 with a good linear at the concentration of 0.05-50.00 ng/mL. The within-run precision was 1.93%-13.81%, and the between-run precision was 4.90%-16.18%. The recoveries were 80.0%-130.6%. ConclusionsThe ID-HPLC-MS/MS is established for simultaneous quantitative determination of 8 kinds of steroid hormones. It has the advantages of sensitivity, specificity and accuracy， which is suitable for the separation and determination of steroid hormones for human serum samples within 10 min.

Key words：Steroid hormone； Serum； Stable isotope dilution； Liquid Chromatography； Tandem mass spectrometry

類固醇激素是一類脂溶性小分子激素，是由膽固醇經(jīng)一系列酶催化而來，其包括雄激素、雌激素和腎上腺皮質(zhì)素，是身體發(fā)育、性成熟及新陳代謝所必須的。人體類固醇激素的升高或者降低與一些臨床疾病如先天性腎上腺增生、多囊卵巢綜合癥、腎上腺皮質(zhì)功能不全等相關(guān)[1-2]。因此，建立一種可以同時準(zhǔn)確測定多種類固醇激素的分析方法對于臨床疾病的診斷具有非常重要的指導(dǎo)意義。

目前，測定類固醇激素常用的方法有放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[5]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)[6-7]。常規(guī)的免疫法操作簡單，但因存在交叉反應(yīng)和基質(zhì)干擾而導(dǎo)致其缺乏特異性，且靈敏度較低[8]。質(zhì)譜法則因靈敏度高和特異性強已成為復(fù)雜基體樣本(如生物樣本)檢測的強有力的工具[9-10]，尤其是LC-MS/MS，已有效地排除了假陽性信號的干擾，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，目前已廣泛應(yīng)用于藥物監(jiān)測[11-12]、新生兒篩查[13-15]、毒理學(xué)診斷[16-17]等多種臨床應(yīng)用領(lǐng)域。我們旨在建立一種能同時測定血清中8種類固醇激素，且前處理相對較簡單、分析時間短、靈敏的同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(isotope dilution high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-HPLC-MS/MS)方法。同位素的加入避免了復(fù)雜混合物體系定量分離、純化的困難，能夠?qū)Υ郎y物含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以便為臨床上男女激素水平的健康評估提供一種可靠的檢測方法，讓醫(yī)師更精確的幫助面臨健康挑戰(zhàn)的人們恢復(fù)激素平衡、改善并預(yù)防慢性病及抗老化。

材料和方法

一、儀器及試劑

API 4000+三重四級桿質(zhì)譜儀(Applied Biosystem公司)；kspert′ultra LC100液相色譜系統(tǒng)(配自動進(jìn)樣器)；醫(yī)用高速冷凍離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；超純水設(shè)備(成都優(yōu)普超純科技有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海森信實驗有限公司)；氮吹儀(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)等。標(biāo)準(zhǔn)品雌酮(estrone，E1)、孕烯醇酮(pregnenolone，P5)、皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)、17α-羥孕酮(17alpha-hydroxyprogesterone， 17α-OHP4)、17-羥孕烯醇酮(17-hydroxylpregnenolone，17-OHP5)、雄烯二酮(androstenedione， AD)、脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone， DHEA)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)購自于美國Sigma-Aldrich公司，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)氘代-雌酮(d2-E1)、d9-P4、d6-DHEA、d8-17OHP4和d3-T購自于加拿大Toronto Research Chemical公司，純度均≥98%；甲醇(色譜純)購自美國ACS公司；甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether， MTBE；純度99.9%)、羥胺購自Sigma-Aldrich公司。配制樂氏生理鹽水來替代空白血清基質(zhì)。方法學(xué)研究實驗的血清樣本來自于上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所2014年6月和7月份送檢患者的血清樣本。

二、ID-HPLC-MS/MS的建立

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品用甲基叔丁基醚準(zhǔn)確定容，然后分裝并放置-80℃保存?zhèn)溆?。取其少量用甲醇?zhǔn)確定容稀釋成濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-20℃保存。按照8種類固醇激素(E1、P5、CORT、17α-OHP4、17-OHP5、AD、DHEA、DHT)在人體血清中的大致含量將標(biāo)準(zhǔn)品按比例配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，再用樂氏生理鹽水稀釋到不同濃度。配制濃度為100 ng/mL的d2-E1、d9-P4、d6-DHEA、d8-17OHP4和d3-T混合內(nèi)標(biāo)水溶液備用。

2. 樣品制備取200 μL血清加入1.5 mL離心管中，加100 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，再加入600 μL MTBE，渦旋振蕩10 min，12 000×g離心5 min，4℃靜置30 min后取上清液用氮吹儀吹干，加入1.5 mol/L羥胺100 μL，混勻振蕩10 min，再放入恒溫箱60℃衍生化反應(yīng)1 h，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

3. 色譜條件采用Phenomenex C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)和Phenomenex C18預(yù)保護(hù)柱。流動相A為H2O含0.1%甲酸，流動相B為甲醇含0.1%甲酸。采用梯度洗脫：0～1.5 min 90%的流動相A，1.5～2.5 min 45%的流動相A，2.5～7.5 min 5%的流動相A，平衡1 min，8.5～10.0 min回到90%的流動相A，流速為0.5 mL/min。柱溫為35℃，進(jìn)樣體積為20 μL。

4. 質(zhì)譜條件在電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)的質(zhì)譜掃描模式。噴霧電壓(ion spray，IS)為5 500 V；碰撞氣(collision gas，CAD)為Medium；氣簾氣(curtain gas，CUR)為40 kPa；離子源霧化氣(ion source GS1，GS1)和加熱輔助氣(GS2)均為60 kPa；去溶劑溫度為550℃。同時監(jiān)測了目標(biāo)物P5(m/z 332.0→86.2)、17α-OHP4(m/z 361.0→112.2)、17-OHP5(m/z 348.0→330.3)、AD(m/z 317.0→112.2)、DHEA(m/z 304.2→253.2)、DHT(m/z 306.2→81.1)、CORT(m/z 410.0→377.2)和E1(m/z 286.0→253.0)以及同位素內(nèi)標(biāo)d2-E1(m/z 288.0→255.1)、d6-DHEA(m/z 310.3→219.2)、d8-17OHP4(m/z 269.2→115.1)和d3-T(m/z 307.0→112.2)。再分別對各個目標(biāo)物的去簇電壓(declustering potential，DP)、碰撞電壓(collision energy，CE)和碰撞池出口電壓(collision cell exit potential，CXP)等條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，以便達(dá)到更高的穩(wěn)定性和靈敏度。

三、方法學(xué)評價

1. HPLC-MS/MS條件優(yōu)化為了得到更加穩(wěn)定且靈敏度高的目標(biāo)物信號，使用羥胺將類固醇激素中的羰基經(jīng)過肟化反應(yīng)[18]，采用MRM模式監(jiān)測其衍生化產(chǎn)物的離子對(Q1/Q3)。首先，是質(zhì)譜方法的建立和條件優(yōu)化，在儀器的質(zhì)量數(shù)已校準(zhǔn)的條件下，激活“Mass Only”，先建立質(zhì)譜采樣方法，需經(jīng)過關(guān)鍵的3步：第1步，Q1 SCAN確定母離子的質(zhì)荷比；第2步，Product Ion Scan確定子離子的質(zhì)荷比；第3步，根據(jù)母、子離子組建MRM離子對Q1/Q3。然后，使用“Ramp”選擇不同離子對的DP、CE和CXP進(jìn)行優(yōu)化，從優(yōu)化色譜圖中即可看到離子最高信號強度所對應(yīng)的最佳結(jié)果。此外，其它一些參數(shù)如IS、CAD、CUR、GS1和GS2等根據(jù)儀器提供的參考范圍選擇合適的數(shù)值，以保證較強的信號強度。其次，優(yōu)化色譜條件，連接LC-MS并平衡色譜柱，根據(jù)色譜分離情況，設(shè)置并優(yōu)化梯度洗脫方法，使得峰型對稱，不要求所有峰都基線分離，但要盡量避免基質(zhì)干擾，優(yōu)化后的梯度洗脫方式詳見上述色譜條件。

2. 內(nèi)標(biāo)定量分析采用同位素內(nèi)標(biāo)定量法進(jìn)行定量分析。利用Analyst軟件以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，并計算出血清中待測物的濃度。同時觀察8種類固醇激素LLOQ的精密度和準(zhǔn)確度，以信噪比(signal-noise ratio, S/N)≥10為標(biāo)準(zhǔn)，獲得每種激素的LLOQ濃度。

3. 方法精密度取送檢的男性混合血清做精密度實驗，嚴(yán)格按照與之前相同的樣品預(yù)處理方法重復(fù)處理10次，計算批內(nèi)精密度。隨后，相同的樣品連續(xù)處理3 d，每天處理3或4個樣品，計算批間精密度。精密度用變異系數(shù)(CV)表示。

4. 回收率實驗隨機選取一例患者的血清樣品，其中1份不加標(biāo)準(zhǔn)品，其它3份分別加入低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，以相同步驟重復(fù)處理并測定3次，計算回收率[回收率(%)=(添加標(biāo)準(zhǔn)品的血清激素濃度-未添加標(biāo)準(zhǔn)品的血清激素濃度)/添加的標(biāo)準(zhǔn)品濃度×100]。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。分別觀察方法的批內(nèi)、批間精密度和回收率。

結(jié)果

一、HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

從優(yōu)化色譜圖中看到的離子最高信號強度所對應(yīng)的最佳結(jié)果見表1。以DHEA和17α-OHP4為例，在優(yōu)化的條件下，獲得的DHEA及其內(nèi)標(biāo)d6-DHEA、17α-OHP4及其內(nèi)標(biāo)d8-17OHP4的提取離子流圖(extracted ion chromatogram，XIC)見圖1。DHEA和17α-OHP4的檢測濃度分別為5 ng/mL和1 ng/mL。從圖1中可以看出雖然檢測濃度很低，但XIC的峰型依然很對稱，雜質(zhì)干擾極小。

表1　類固醇激素的條件優(yōu)化結(jié)果

注：(a)DHEA；(b)內(nèi)標(biāo)d6-DHEA；(c)17α-OHP4；(d)內(nèi)標(biāo)d8-17OHP4

圖1DHEA及其內(nèi)標(biāo)d6-DHEA、17α-OHP4及其內(nèi)標(biāo)d8-17OHP4的XIC圖

二、 內(nèi)標(biāo)定量分析

8種類固醇激素在0.05～50.00 ng/mL范圍內(nèi)的線性擬合方程顯示線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.998 0，滿足定量檢測要求，見表2。8種類固醇激素的LLOQ見表2。

三、 精密度

批內(nèi)精密度為1.93%～13.81%，批間精密度為4.9%～16.18%，見表3。

表2　類固醇激素的線性擬合、最低定量限和檢出限結(jié)果

表3　8種類固醇激素的精密度結(jié)果

四、 回收率實驗

8種激素的加標(biāo)回收率為80.0%～130.6%，3次重復(fù)試驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.6%～12.7%。見表4。

表4　8種類固醇激素的加標(biāo)回收率結(jié)果

討論

本研究采用ID-HPLC-MS/MS同時測定了血清中8種類固醇激素。目前，操作簡單和成本低是免疫法的優(yōu)勢，但因其存在交叉反應(yīng)和基質(zhì)干擾而導(dǎo)致缺乏特異性，而且靈敏度較低。LC-MS/MS是同時針對目標(biāo)物的出峰時間和離子對進(jìn)行檢測，靈敏度高，可極大的避免交叉反應(yīng)的干擾。與此同時，采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量可以極大的消除基體的干擾，而且不受預(yù)處理過程、上樣體積和流動相等條件的影響，能夠達(dá)到準(zhǔn)確定量。

為了提高分析物的離子化效率，利用柱前衍生化法，采用羥胺與類固醇激素中的羰基發(fā)生衍生化反應(yīng)，極大地提高了分析的靈敏度和穩(wěn)定性，LLOQ(以S/N≥10為標(biāo)準(zhǔn))可低至每毫升幾十皮克，基本滿足血清中一些痕量激素的檢測要求。

本研究還觀察了ID-HPLC-MS/MS檢測8種激素的重現(xiàn)性和回收率。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度為1.93%～13.81%，批間精密度為4.90%～16.18%，除E1的批間精密度相對略差外，其它7種類固醇激素的精密度均<15%[可接受標(biāo)準(zhǔn)為CV≤15%，但此標(biāo)準(zhǔn)也與待測物的濃度有關(guān)，若濃度過低(ng/mL級以下)可放寬至CV≤20%]。因此，該方法穩(wěn)定性良好。此外，加標(biāo)回收率為80.0%～130.6%，可接受標(biāo)準(zhǔn)為80%～120%，若濃度較低，可接受范圍可放寬至70%～130%，而E1的回收率為130.6%。因此，除E1回收率相對略差外，其它7種激素基本可滿足臨床定量檢測要求。與其它幾種激素相比，E1的精密度和回收率較差，可能是由于其在人血清內(nèi)的含量較低，相對而言儀器對它的S/N較大，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的誤差變大；精密度較差也可能與樣品的保存、預(yù)處理過程和基體中其它物質(zhì)對其的干擾有關(guān)。因此，可以通過定期清洗儀器或ESI噴霧針等方式盡量降低背景干擾，還可以選擇更高性能的質(zhì)譜儀器來檢測含量過低的物質(zhì)，如E1等。

綜上所述，本研究建立的ID-HPLC-MS/MS靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確且前處理過程較簡單，10 min內(nèi)可完成多種激素的分離和檢測，精密度與加標(biāo)回收率能基本滿足臨床定量檢測要求，可用于臨床上血清類固醇激素的定量分析，為臨床上男、女性激素水平的評估提供一種可靠的檢測方法。

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(本文編輯：龔曉霖)

收稿日期：(2014-12-12)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0427-06R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.005

通訊作者：于嘉屏，聯(lián)系電話：021-51816497。

作者簡介：周亞飛，女，1987年生，碩士，主要從事生物有機質(zhì)譜分析。