·基礎(chǔ)研究·

坤泰膠囊對促排卵小鼠子宮內(nèi)膜溶血磷脂酸受體3、環(huán)氧合酶2表達(dá)的影響

王慧，李玉潔，南燕，陳帆

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453003)

摘要：目的觀察坤泰膠囊對促排卵小鼠子宮內(nèi)膜溶血磷脂酸受體3(LPAR3)、環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)的影響，探討其是否具有提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。方法將90只6～8周齡的昆明雌鼠隨機(jī)分為三組，各30只。A組：每天生理鹽水灌胃1次(連續(xù)1個(gè)月)，控制性超促排卵(COH)；B組：每天坤泰膠囊生理鹽水溶解后灌胃1次(連續(xù)1個(gè)月)，COH；C組：每天生理鹽水灌胃1次(連續(xù)1個(gè)月)。雌鼠與雄鼠以2∶1合籠，檢查雌鼠次日晨陰栓(按天數(shù)表示為d1～d6)。每天每組處死5只雌鼠，取其子宮，觀察子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育情況，檢測其LPAR3、COX-2。結(jié)果d4，A、B、C組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)分別為(13±3)、(20±2)、C(17±2)個(gè)，B組與A、C組相比，P均<0.05。d3,A、B、C組子宮內(nèi)膜LPAR3的積分光密度值(IOD值)分別為0.293±0.019、0.255±0.014、0.253±0.032，B組與A組相比，P<0.05；d4，A、B、C組子宮內(nèi)膜LPAR3的IOD值分別為0.207±0.022、0.330±0.026、0.311±0.019，B組與A組相比，P<0.05。d4、d5、d6，A組子宮內(nèi)膜COX-2的IOD值分別為0.282±0.019、0.419±0.052、0.573±0.057,B組分別為0.176±0.018、0.288±0.020、0.417±0.053,兩組相比，P均<0.05。結(jié)論坤泰膠囊可調(diào)控COH小鼠子宮內(nèi)膜LPAR3及COX-2的表達(dá)，發(fā)揮提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。

關(guān)鍵詞：坤泰膠囊；控制性超排卵；子宮內(nèi)膜容受性；溶血磷脂酸受體3；環(huán)氧合酶2；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.008

中圖分類號：R714 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：河南省高等學(xué)校骨干教師科研基金資助項(xiàng)目(2012GGJS-135)。

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：李玉潔

在輔助生殖技術(shù)的實(shí)施過程中，控制性超促排卵(COH)技術(shù)的應(yīng)用，使得獲取高質(zhì)量的卵子成為可能，但是胚胎的臨床妊娠率卻一直徘徊在30%～40%[1]。子宮內(nèi)膜容受性因此而成為研究的熱點(diǎn)。坤泰膠囊由熟地黃、黃連、白芍、阿膠、黃芩、茯苓等中藥組成，對更年期大鼠具有增加子宮濕重及子宮營養(yǎng)的作用[2]。2014年5月25日～8月25日，我們觀察了坤泰膠囊對促排卵小鼠子宮內(nèi)膜溶血磷脂酸受體3(LPAR3)、環(huán)氧合酶2(COX-2)表達(dá)的影響，探討其是否具有提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級6～8周齡昆明雌鼠90只，8～10周齡昆明雄鼠45只，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由取食水，室溫22～25 ℃。將雌鼠隨機(jī)分為A、B、C組，各30只，三組雌鼠體質(zhì)量有可比性。

1.2方法

1.2.1坤泰膠囊給予方法及COH方法B組：將坤泰膠囊生理鹽水溶解后(濃度為50 mg/mL)灌胃1個(gè)月，每只每天0.7 mL(根據(jù)許文生公式和Meeh-Rubner公式計(jì)算確定)。A、C組：生理鹽水灌胃1個(gè)月,每只每天0.7 mL。各組于灌胃第2天開始，采用陰道涂片法觀察雌鼠動(dòng)情周期(分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期)。三組灌胃20 d后，即小鼠發(fā)情后期，A、B兩組于上午9時(shí)腹腔注射促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRHa)1.5 μg/100 g，連續(xù)9 d，第9天加注孕馬血清(PMSG)10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只;C同組時(shí)注射同等劑量生理鹽水。HCG注射日當(dāng)晚，按雌鼠∶雄鼠=2∶1的比例將A、B、C三組雌鼠與雄鼠合籠，次日晨7～8時(shí)檢查三組雌鼠的陰栓，連續(xù)6 d(按天數(shù)表示為d1～d6)。

1.2.2標(biāo)本的獲取、子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù)及LPAR3和COX-2的檢測d1～d6，A、B、C三組每天每組處死5只雌鼠，取其子宮組織，4%多聚甲醛固定、切片。部分子宮組織切片HE染色后，×400顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)5個(gè)視野腺體數(shù)之和，以此作為一個(gè)樣本量(各組僅統(tǒng)計(jì)d4的子宮內(nèi)膜腺體數(shù))。部分子宮組織切片免疫組化染色，采用Image-Plus6.0軟件進(jìn)行光密度矯正后測量LPAR3、COX-2的IOD值,隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野的積分光密度值(IOD值)，取5個(gè)視野IOD值的平均值作為一個(gè)樣本量。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1d4的A、B、C組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)比較d4，A、B、C組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)分別為(13±3)、(20±2)、(17±2)個(gè)；B組與A、C組相比，P均<0.05；B組與C組相比，P>0.05。

2.2A、B、C組子宮內(nèi)膜LPAR3表達(dá)比較A、B、C組子宮內(nèi)膜LPAR3的IOD值比較見表1。

表1　A、B、C組LPAR3的IOD值比較

注：與A組同一時(shí)間點(diǎn)相比，*P<0.05。

2.3A、B、C組子宮內(nèi)膜COX-2表達(dá)比較A、B、C組子宮內(nèi)膜COX-2的IOD值比較見表2。

表2　 A、B、C組COX-2的IOD值比較

注：-表示未檢測到；與A組同一時(shí)間點(diǎn)相比，*P<0.05。

3討論

本研究結(jié)果顯示，A組子宮內(nèi)膜腺體少,推測COH可能在一定程度上影響子宮內(nèi)膜容受性而導(dǎo)致臨床妊娠率低[2,3]。因此，在輔助生殖技術(shù)的實(shí)施過程中，解決COH導(dǎo)致的種植窗期子宮內(nèi)膜容受性低下的問題，是解決胚胎種植率低的切入點(diǎn)。

溶血磷脂酸(LPA)存在于機(jī)體的血清、房水、精漿等多種體液中，其受體有四種，分別為LPAR1～4。LPAR3基因缺陷的雌性小鼠子宮內(nèi)膜COX-2、前列腺素(PGS)表達(dá)降低，并出現(xiàn)胚胎種植的延遲[4]。COX-2是合成PGS的限速酶。郭燕紅等[5]推測LPAR3可能通過LPAR3/COX-2/PGS下游信號來調(diào)節(jié)胚胎著床，COX-2基因突變的雌鼠可以表現(xiàn)出多種生殖功能異常。本研究結(jié)果顯示，LPAR3表達(dá)于雌鼠子宮內(nèi)膜上皮及腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)，且在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)具有規(guī)律性，均有峰值出現(xiàn)，A組峰值出現(xiàn)在d3，B、C組出現(xiàn)d4，B組峰值高于A組;COX-2主要分布于雌鼠子宮內(nèi)膜上皮、腺上皮、基質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，且在LPAR3峰值出現(xiàn)時(shí)開始表達(dá)，A組的COX-2較B、C兩組出現(xiàn)早。

小鼠子宮內(nèi)膜的種植窗為雌雄合籠后第4日至第5日晨，約18 h[6]。胞飲突為目前公認(rèn)的子宮內(nèi)膜容受性評價(jià)指標(biāo)之一，雌雄鼠在合籠第4天出現(xiàn)完全發(fā)育的胞飲突[5]。本研究的B組與C組LPAR3峰值均出現(xiàn)在d4，COX-2于d4開始出現(xiàn)，與胞飲突出現(xiàn)時(shí)間一致，且B組LPAR3峰值高于A組峰值。可見坤泰膠囊在改善子宮內(nèi)膜發(fā)育不良的同時(shí)，也改善了COH引起的LPAR3、COX-2表達(dá)異常。A組LPAR3峰值提前出現(xiàn)且較B組低，COX-2出現(xiàn)較早，d4腺體發(fā)育不良；B組d4天腺體較多、LPAR3表達(dá)較高。研究[7]發(fā)現(xiàn)，COX-2誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGS是胚胎著床、子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中增加內(nèi)膜血管通透性及胎盤血管形成至關(guān)重要的因子。坤泰膠囊可能主要是改善COH小鼠子宮內(nèi)膜上LPAR3的時(shí)空表達(dá)，從而間接改善COX-2的適時(shí)表達(dá)，起到改善小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育、提高子宮內(nèi)膜容受性的作用。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 郭燕紅，張雷，邵素霞，等.溶血磷脂酸受體3在小鼠胚胎圍著床期子宮內(nèi)膜的表達(dá)及意義[J].解剖學(xué)報(bào)，2009,40(1)：141-145.

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