■劉 盼 劉新利

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟南250300）

我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物的含量非常高，以農(nóng)作物秸稈為例，我國農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量位于世界前列，2009年農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量為7.4億噸。農(nóng)作物秸稈分布范圍廣，數(shù)量大，并且含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和無氮浸出物等化學(xué)成分，據(jù)研究分析，每千克玉米秸稈干物質(zhì)消化能9.35 MJ，如果充分利用可以為國家節(jié)約大量的糧食，因此具有作為飼料原料的潛力，但是由于它們比較粗硬、適口性不好、營養(yǎng)價值較差、消化利用率比較低等特點，實際上作為飼料的植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物的量很低。另外單胃動物一般不能利用秸稈，反芻動物對秸稈的消化率也僅有20%～30%。如果想要將植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物作為一種飼料就必須對其進行加工處理，增加其營養(yǎng)價值，提高動物的采食量和消化率。

綠色木霉和枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生纖維素酶，黃孢原毛平革菌能夠產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶。重組畢赤酵母產(chǎn)生的阿魏酸酯酶為半纖維素降解酶系的組成之一，參與植物細(xì)胞壁的交聯(lián)部分的分解，可以將半纖維素之間以及半纖維素與木質(zhì)素之間的酯鍵打斷，釋放阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，促進半纖維素、木質(zhì)素和纖維素的分離，為纖維素的進一步酶解提供條件。綠色木霉和黃孢原毛平革菌分別是重要的纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌。本文主要是利用綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母（阿魏酸酯酶）對植物纖維性農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈進行降解。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

玉米秸稈，來自濟南市長清區(qū)，烘干粉碎過50目篩，原材料中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為41%、25%和16%。

1.2 培養(yǎng)基

YPED培養(yǎng)基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水1 000 ml。

YPED固體培養(yǎng)基：配方同上，再加2%的瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、水1 000 ml。

發(fā)酵培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基加研磨后的玉米秸稈（過50目篩）。

1.3 方法

1.3.1 四株菌之間的拮抗作用

為了探究四株菌在玉米秸稈發(fā)酵過程中有無拮抗作用，進行了四株菌之間的拮抗試驗。在YPED培養(yǎng)基平板上劃四個區(qū)，分別在每個區(qū)接一株菌，30℃倒置培養(yǎng)，3 d后觀察，選擇無拮抗作用的菌株進行后續(xù)試驗。

小說家又說：“日本童話大師安房直子有一篇童話《狐貍的窗戶》，講述了一個小狐貍開了一家印染店的故事。如果小狐貍不狡猾，它能開成印染店嗎？”女孩似乎聽明白一些，點點頭，而富翁卻像聽傻了一般，雙眼直勾勾地盯著小說家。

1.3.2 混合菌液發(fā)酵玉米秸稈制備飼料

準(zhǔn)確稱取適量的玉米秸稈，添加相同比例的相互間無拮抗作用的綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母的混合菌液，控制適當(dāng)溫度、pH值、固液比和培養(yǎng)時間，測定還原糖含量。

1.3.3 還原糖含量的測定

利用還原糖測定儀測定還原糖含量。

1.3.4 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定

利用NREL法測纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 四株菌之間的拮抗

在YPED培養(yǎng)基平板上劃四個區(qū)，將培養(yǎng)到對數(shù)期的綠色木霉、黃孢原毛平革菌、枯草芽孢桿菌和重組畢赤酵母分別接種在不同的區(qū)上，30℃倒置培養(yǎng)，3 d后觀察，試驗結(jié)果見圖1。

圖1 混合菌液處理之后的玉米秸稈的紅外光譜圖

由圖1可以看出，枯草芽孢桿菌對畢赤酵母、綠色木霉和黃孢原毛平革菌有抑制作用，能看到明顯的抑菌圈，其余的三株菌之間沒有明顯的抑菌圈，可以共生長。所以本試驗選擇綠色木霉、黃孢原毛平革菌和重組畢赤酵母作為秸稈處理的微生物菌株。

2.2 三株菌的添加順序

取90 ml PDA培養(yǎng)基和10 g玉米秸稈，115℃滅菌30 min。由于重組畢赤酵母需要甲醇的誘導(dǎo)，故將重組畢赤酵母放在最后。因此三株菌的添加順序按照兩種不同的方案進行，第一種方案是加入10 ml綠色木霉，培養(yǎng)2 d后再加10 ml黃孢原毛平革菌，再培養(yǎng)2 d后加入10 ml重組畢赤酵母，培養(yǎng)1 d后加1 ml甲醇誘導(dǎo)。第二種方案與第一種方案相似，只是先添加黃孢原毛平革菌后添加綠色木霉。對照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 菌的添加順序?qū)€原糖產(chǎn)量的影響

由圖2可知，第一種方案比第二種方案的還原糖的含量高。測樣的第7 d產(chǎn)生的還原糖的量為8.863 mg/ml，與王巍杰等采用白腐真菌降解玉米秸稈制備飼料時在30℃、pH值8.5和固液比1∶15的條件下發(fā)酵72 h，玉米秸稈飼料中還原糖含量增加13.77%發(fā)酵相比，本試驗還原糖產(chǎn)生量不如王巍杰等人的高，但是比先添加黃孢原毛平革菌的試驗組的產(chǎn)還原糖量高26.9%。所以本試驗采用第一種方案的添加順序進行后續(xù)試驗。

2.3 混合菌液處理秸稈的溫度優(yōu)化

混合菌按照上述第一種方案對玉米秸稈發(fā)酵處理的溫度優(yōu)化。發(fā)酵液分別在20、25、30、37、42 ℃溫度下，200 r/min搖床培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)結(jié)束后開始測樣，對照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖含量，試驗結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃時，秸稈的發(fā)酵效果最好；發(fā)酵周期大約在測樣的第9 d，還原糖的最高產(chǎn)量為12.424 mg/ml。比朱易佳用pH值4.5的稀堿預(yù)處理稻稈后再加入發(fā)酵稻稈的混合酶制劑（阿魏酸酯酶、木聚糖酶、纖維素酶）在45℃下酶解12 h，酶解產(chǎn)生的還原糖為0.06 g/g相比，還原糖產(chǎn)生率高50%。發(fā)酵后期還原糖產(chǎn)量的降低可能主要是菌株老化導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低和菌株自身新陳代謝的消耗。

2.4 混合菌液處理秸稈的pH值優(yōu)化

對混合菌液處理秸稈的pH值在4、5、6、7、8、9的范圍內(nèi)進行優(yōu)化，30℃、200 r/min條件下，操作同菌液添加順序的第一個方案，對照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 菌的培養(yǎng)pH值對還原糖產(chǎn)量的影響

由圖4可知，隨著pH值的增加還原糖產(chǎn)量也逐漸增加，但是菌液在pH值為7時對秸稈的降解效果最好，還原糖的產(chǎn)量最高，為13.291 mg/ml。但是與Tabka等將蒸汽爆破的小麥秸稈添加0.1%（w/v）的Tween20和阿魏酸酯酶、纖維素酶、木聚糖酶，在50℃條件下共同作用，釋放了51.4%的還原糖相比，還原糖的產(chǎn)生量低，可能是因為Tween20對秸稈的酶解反應(yīng)有一定的促進作用。

2.5 混合菌液處理秸稈的固液比優(yōu)化

對混合菌液處理秸稈的固液比在1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶15的比例下進行優(yōu)化。30 ℃，200 r/min、pH值7.0的條件下，菌液的添加順序按照第一個方案進行，對照組加相應(yīng)的滅菌的蒸餾水。測定還原糖的含量，試驗結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)固液比為1∶9時，混合菌液對玉米秸稈的降解效果最好，產(chǎn)生的還原糖的量最大。

圖5 菌的培養(yǎng)固液比對還原糖產(chǎn)量的影響

2.6 纖維降解率與紅外分析

最后發(fā)酵完成之后發(fā)酵液的狀態(tài)如圖6所示，由圖6可以看出，玉米秸稈處理前發(fā)酵液比較黏稠，處理后由于纖維類物質(zhì)的降解，結(jié)構(gòu)疏松，發(fā)酵液靜止1 h后能明顯看出澄清液體。最后利用NERL法測定混合菌液處理后的玉米秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量分別為32%、22%和11%；降解率分別為21.95%、12%和31.25%。

從圖7看出，玉米秸稈經(jīng)過混合菌液協(xié)同處理之后的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在阿魏酸酯鍵、木質(zhì)素的芳環(huán)和纖維素上的碳氧雙鍵伸縮振動的特征吸收峰的變化，它們的特征吸收峰分別為1 700 cm-1、1 600 cm-1、1 300 cm-1左右。沒有經(jīng)過混合菌液處理的玉米秸稈的阿魏酸酯鍵、木質(zhì)素和纖維素的特征吸收峰與經(jīng)過混合菌液處理之后的其相應(yīng)的特征吸收峰強。這說明三種菌株之間的協(xié)同處理玉米秸稈的作用比較明顯，秸稈的降解效果好。

圖6 秸稈處理前后對比（左邊處理前，右邊處理后）

圖7 混合菌液處理之后的玉米秸稈的紅外光譜

3 討論與結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綠色木霉、黃孢原毛平革菌和畢赤酵母（重組阿魏酸酯酶）以相同比例對玉米秸稈進行發(fā)酵時，以還原糖產(chǎn)量作為考察指標(biāo)確定玉米秸稈飼料制備的最佳工藝為：玉米秸稈添加量10 g、pH值7，固液比1∶9在30℃培養(yǎng)9 d?；旌暇簩τ衩捉斩挼慕到庑Ч己?，能夠有效地降解玉米秸稈中的纖維素和木質(zhì)素，為今后的產(chǎn)業(yè)化提供了試驗基礎(chǔ)。目前，專家學(xué)者對秸稈降解的研究多停留在液體培養(yǎng)的條件下。本試驗以玉米秸稈作為半固體基質(zhì)，對綠色木霉、黃孢原毛平革菌和阿魏酸酯酶重組菌株畢赤酵母的混合菌液進行半固體處理，尋找出一種有效地降解玉米秸稈的方法，為后期將玉米秸稈的飼料化提供了理論基礎(chǔ)。本次試驗只是涉及了實驗室培養(yǎng)階段，對于大規(guī)模的工程培養(yǎng)和動物實驗還需要進一步研究。

（參考文獻10篇，刊略，需者可函索）