■郭琳娜 王雁萍 袁世超 楊慧曉

（1.鄭州大學(xué)離子束生物工程省重點實驗室，河南鄭州450052；2.安圖生物工程科技股份有限公司，河南鄭州450016）

近年來，隨著我國畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展以及種植業(yè)的積極調(diào)整使得苜蓿大規(guī)模種植及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)快速推廣成為可能。苜蓿自然附著戊糖片球菌、乳酸乳球菌、腸系明串珠菌、植物乳桿菌等乳酸菌，這些乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中起著重要作用。

然而，苜蓿自然附生的乳酸菌量較少，為1×101～3×105CFU/(g·FW)[1]，難以達到所需數(shù)量，加之苜?？扇苄蕴呛康停话阍?.72%（DM）左右，無法達到發(fā)酵成優(yōu)質(zhì)青貯飼料所需的最低含糖量9.5%（DM）[2]，使得苜蓿在青貯過程中需要使用添加劑來提高青貯品質(zhì)。乳酸菌是綠色環(huán)保的生物添加劑，篩選高抑菌活性及產(chǎn)酸性能，尤其是在低可溶性糖環(huán)境中產(chǎn)酸能力較強的優(yōu)良乳酸菌，能夠降低青貯飼料的pH值，有利于抑制有害菌的生長，從而達到長期保存飼料營養(yǎng)物質(zhì)的目的[3]。

本試驗旨在從上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中篩選出抑菌活性較好，在低可溶性糖環(huán)境中產(chǎn)酸能力較強的優(yōu)良菌株，為苜蓿青貯用乳酸菌添加劑的研究和開發(fā)提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

乳酸菌菌株共67株，均為實驗室保存，分離自上海地區(qū)苜蓿的35個樣品，其品種包括巨人802、金達、王冠、CW608、ST201、德福、AB1700、WL525、豐寶、射手等。

1.2 指示菌株

沙門氏菌(Salmonella enterica)、大腸桿菌(Escherichia coli)、李斯特氏菌(Listeriosis)，為實驗室保存。

1.3 試劑及培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基，過氧化氫酶，API 50。

2 實驗方法

2.1 抑菌活性的測定

將保存于-80℃冰箱中的67株乳酸菌活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌發(fā)酵上清液(12 000 r/min、4℃離心10 min)；分別挑取各種指示菌的單菌落在NA培養(yǎng)基上劃線，30℃恒溫培養(yǎng)24 h制備指示菌菌懸液，采用牛津杯雙層平板法[4]進行抑菌試驗，并對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2.2 產(chǎn)酸性能的測定

將活化的乳酸菌菌液按6%的比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，以不接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照，30℃靜置培養(yǎng)。期間每隔2 h取1次樣，連續(xù)取到36 h，測定pH值。

2.3 在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中乳酸菌發(fā)酵性能的檢測方法

將篩選到的乳酸菌接種于葡萄糖含量為0.5%的液體MRS培養(yǎng)基中，以不接種乳酸菌的0.5%葡萄糖MRS液體培養(yǎng)基為對照，每12 h測定培養(yǎng)基的pH值進行統(tǒng)計分析。

2.4 乳酸菌發(fā)酵苜蓿粉性能的檢測方法

將苜蓿放置于65℃烘箱48 h烘干水分，利用粉碎機將其粉碎，制備苜蓿粉備用。將活化后的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h，制備乳酸菌菌液備用。稱取苜蓿粉1 g于自封袋中，按66.7%的含水量加2 ml無菌水，并加入3 μl乳酸菌菌液，加菌處理的袋每種4份，不加菌的袋也有4份作為對照，混勻，密封，放置于30℃培養(yǎng)箱。分別于培養(yǎng)12、24、36、48 h后開封，開封后每袋樣品中加入27 ml蒸餾水，充分混勻，測定其pH值進行統(tǒng)計分析。

2.5 菌株的理化特征測定方法

①耐鹽濃度試驗:將菌株分別接種于含有3.0%和6.5%NaCl的液體MRS培養(yǎng)基(pH值6.5)中，30℃培養(yǎng)48 h，對照組培養(yǎng)基為不含NaCl的MRS液體培養(yǎng)基。

②pH值生長范圍試驗:分別將菌株接種于pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0、10.0的MRS液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng) 7 d，對照組培養(yǎng)基為 pH值6.5的MRS液體培養(yǎng)基。

③溫度生長范圍試驗:將菌株接種于pH值6.5的MRS液體培養(yǎng)基，分別放置于5、15、45、50 ℃下培養(yǎng)，其中45℃ 和50℃下培養(yǎng) 7 d，5℃和 15℃下培養(yǎng)14 d，對照組設(shè)置為30℃條件下培養(yǎng)7 d。

④菌株的過氧化氫酶試驗、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗（同型或異型發(fā)酵試驗）、碳源發(fā)酵特性等，具體方法參照龐會利（2001）[5]。

2.6 分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種于MRS固體平板上培養(yǎng)48 h備用。PCR引物選用細菌的16S rRNA基因擴增的通用引物 ：27F(5’-AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR 反應(yīng)體系為50 μl：Premix Taq25 μl，27F和1492R（均為20 μM）1 μl，補充滅菌蒸餾水至50 μl，直接將菌落加入反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)。將菌落PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果在GeneBank中使用Blast程序?qū)ふ遗c其最大同源性的序列。并將測序所得16S rRNA基因序列和通過Blast在GenBank中得到的標準菌株序列信息一起導(dǎo)入CLUSTAL W軟件進行比對。將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis NCDO 1769T作為外圍菌株，采用MEGA 5.02軟件中的鄰接法構(gòu)建進化樹[6-7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌的抑菌活性

在指示菌相同濃度下，67株上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中對G+指示菌（李斯特氏菌）的抑菌率較高，而對G-指示菌（大腸桿菌和沙門氏菌）的抑菌率較低，如圖1所示。對李斯特氏菌的抑菌率達77.61%，而對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率分別為65.67%和13.70%。

圖1 上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌發(fā)酵上清液對指示菌的抑菌率

其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105、ZZU A106、ZZU A110和ZZU A157這7株菌對3種指示菌均有抑制作用。對李斯特氏菌抑制作用最強的是菌株ZZU A95，對大腸桿菌抑制作用最強的是菌株ZZU A104，對沙門氏菌抑制作用最強的是菌株ZZU A157，結(jié)果如表1所示。

3.2 乳酸菌的產(chǎn)酸性能

對上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌中具有較好抑菌作用的7株菌進行產(chǎn)酸性能的測定，發(fā)現(xiàn)所有菌株在0～12 h產(chǎn)酸速率較快，12～24 h逐漸變緩，24～36 h趨于平穩(wěn)。其中 ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105這4株菌發(fā)酵12 h內(nèi)的pH值下降較快，24 h后pH 值分別達到 3.57、3.99、3.85、3.96，均降至 4.0以下。結(jié)果如圖2所示。

表1 乳酸菌的抑菌活性

圖2 分離菌株不同時間發(fā)酵上清液pH值

3.3 乳酸菌在低可溶性糖條件下的發(fā)酵特性

3.3.1 在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵性能

將具有較強抑菌作用且產(chǎn)酸性能較好的4株菌在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示。所有試驗菌株培養(yǎng)至12 h時培養(yǎng)基的pH值均降至5.0以下，其中菌株ZZU A95在培養(yǎng)至24 h時培養(yǎng)基的pH值最低，達到4.32，表明其在低糖環(huán)境中產(chǎn)酸性能最好。

表2 乳酸菌在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體中發(fā)酵不同時間的pH值

3.3.2 發(fā)酵苜蓿粉的性能

將具有較強抑菌作用且產(chǎn)酸性能較好的4株菌分別接種于苜蓿粉中進行發(fā)酵試驗，每12 h開封測定苜蓿粉的pH值。結(jié)果如表3所示，試驗組在發(fā)酵過程中苜蓿粉的pH值均低于不加菌的對照組。對照組苜蓿粉的pH值呈上升趨勢，而除菌株ZZU A101外，接種其余乳酸菌發(fā)酵48 h時苜蓿粉的pH值均下降至5.0以下。其中接種菌株ZZU A95效果最好，在發(fā)酵至48 h時苜蓿粉的pH值降至4.78。

表3 發(fā)酵不同時間苜蓿粉的pH值

3.4 優(yōu)良菌株的菌種鑒定

對具有較強抑菌活性和在低可溶性糖環(huán)境下產(chǎn)酸性能較好的ZZU A95菌株進行生理生化指標的測定,結(jié)果表明，ZZU A95是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應(yīng)陰性的同型發(fā)酵球菌；能夠在pH值3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0條件下生長，在pH值3.0條件下微弱生長；能夠在5～45℃溫度范圍內(nèi)生長；能夠在NaCl濃度≤6.5%(W/V)的環(huán)境中生長。

碳源發(fā)酵結(jié)果如表4所示，菌株ZZU A95能夠利用的碳源較廣泛，能夠很好地利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、D-松二糖、D-塔塔糖這21種碳源，微弱利用D-阿拉伯糖和攏牛兒糖。

表4 菌株ZZU A95的碳源發(fā)酵特性

將ZZU A95菌株的16S rRNA(約1 500 bp)序列在GeneBank中使用Blast程序進行比對，結(jié)果表明，菌株ZZU A95與多株戊糖片球菌的16S rRNA序列相似性達99%以上。將其序列使用MEGA 5.02軟件采用Neighbor-joining法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹見圖3。

根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等特征將篩選的菌株ZZU A95鑒定為戊糖片球菌。

4 討論

由于苜蓿自然附生乳酸菌對其材料本身具有較好的生長適應(yīng)性，因此從中篩選適合用作青貯添加劑的優(yōu)良乳酸菌方法更為有效。新鮮苜蓿的表面附著的有害菌，主要是腸桿菌目（Enterobacteriales）比例大[8]，例如大腸桿菌會引起畜禽腸道腹瀉等疾病，對牲畜的健康造成極大的影響。而青貯時乳酸菌通過厭氧呼吸將青貯飼料中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機酸，使青貯環(huán)境的pH值下降，同時產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，抑制有害菌的生長，從而降低飼料在青貯過程中的營養(yǎng)消耗及腐敗風(fēng)險[9]。本研究通過對G+和G-指示菌的抑菌試驗對上海地區(qū)苜蓿附生乳酸菌進行篩選，以期篩選在青貯過程中抑制腐敗菌生長活性較強的乳酸菌。研究發(fā)現(xiàn)，所分離的67株乳酸菌中對李斯特氏菌（G+）的抑菌率較高，其中ZZU A95的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最佳，對大腸桿菌（G-）和沙門氏菌（G-）也有較好抑制作用。

圖3 菌株ZZU A95的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進化樹

產(chǎn)酸性能是篩選青貯用優(yōu)良乳酸菌的一個非常重要的指標[10]。本研究從抑菌實驗篩選出的7株乳酸菌進行產(chǎn)酸性能測定。其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105這4株菌發(fā)酵24 h后pH值均降至4.0以下。其中ZZU A95的pH值最低，達到3.57，能夠滿足快速降低環(huán)境pH值的要求。

苜蓿的可溶性糖含量較低，因此，篩選能夠在低可溶性糖環(huán)境中快速產(chǎn)酸的乳酸菌成為關(guān)鍵。本試驗對4株產(chǎn)酸性能較好的乳酸菌進行低可溶性糖條件下的發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)其均能夠在葡萄糖濃度為0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中生長，并降低環(huán)境的的pH值，其中菌株ZZU A95效果最為明顯，并且菌株ZZU A95在發(fā)酵苜蓿粉過程中產(chǎn)酸較穩(wěn)定。不接種乳酸菌的對照組和接種菌株ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105的實驗組在發(fā)酵36 h時苜蓿粉樣品出現(xiàn)明顯的酸臭氣味，可能是由于這些樣品中乳酸菌產(chǎn)酸量不足，不能有效抑制腐敗菌的繁殖，在48 h時樣品的氣味恢復(fù)正常，可能與此階段pH值未有明顯上升有關(guān)。而接種菌株ZZU A95的苜蓿粉在發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯的酸臭氣味，可能與菌株ZZU A95具有較強的抑菌活性和產(chǎn)酸性能有關(guān)。

苜蓿的細胞壁結(jié)構(gòu)性糖（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）含量豐富，然而不易被乳酸菌利用。而傳統(tǒng)的青貯乳酸菌基本屬于利用可溶性糖的乳酸菌，能否開發(fā)出分解植物細胞壁結(jié)構(gòu)性糖的乳酸菌，促進纖維素及半纖維素的分解和利用，進而提高苜蓿青貯品質(zhì)，是一個非常值得探索和深入研究的問題。本研究中，ZZU A95菌株可利用的碳源較多，包括纖維二糖和D-木糖。菌株ZZU A95是否具有降解結(jié)構(gòu)性糖的相關(guān)酶基因和對結(jié)構(gòu)性糖的分解能力，以及作為青貯用乳酸菌在生產(chǎn)中的實際應(yīng)用效果，將有待進一步研究。

5 結(jié)論

從上海苜蓿附生乳酸菌中篩選的優(yōu)良乳酸菌ZZU A95屬于同型發(fā)酵兼性厭氧型乳酸菌，碳源利用較廣泛，具有較強的抑菌活性和低可溶性糖環(huán)境下較好的產(chǎn)酸性能，可作為青貯用乳酸菌的潛在開發(fā)菌株。