■趙夢(mèng)迪 陳天龍 張 敏

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133000）

近年來,由于科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,人類精神文明和物質(zhì)文明的提高，綠色觀念已深入人心。早在90年代，在飼料行業(yè)中抗生素的廣泛使用曾給畜牧業(yè)帶來了較高的經(jīng)濟(jì)效益和飛速發(fā)展（馬永生等，2005；劉世杰等，2004）。我國(guó)部分飼料生產(chǎn)者和養(yǎng)殖戶，由于技術(shù)不夠完善等原因，進(jìn)而造成抗生素被超量使用，從而導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品中藥物殘留、免疫力下降以及環(huán)境污染等問題，直接危害著人類的健康（姚軍虎等，2000）。一系列研究報(bào)道指出，微生態(tài)復(fù)合制劑具有不污染環(huán)境、不會(huì)殘留在畜產(chǎn)品體內(nèi)、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)（劉棟等，2008）。同時(shí)，延長(zhǎng)蛋雞的產(chǎn)蛋周期也是養(yǎng)殖業(yè)的重點(diǎn)之一。根據(jù)自由基學(xué)說，提高抗氧化性可以延緩衰老，進(jìn)一步延長(zhǎng)生產(chǎn)周期（吳振庚等，1981）。結(jié)合二者本試驗(yàn)主要是研究酵母-紅曲霉復(fù)合制劑與抗氧化性能的關(guān)系，進(jìn)一步為微生態(tài)類綠色飼料添加劑的大規(guī)模生產(chǎn)使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母菌的培養(yǎng)：選取純化酵母菌株擴(kuò)繁，培養(yǎng)溫度為25～28℃，約2～3 d，然后保存于斜面管中，在-4℃冰箱中保存待用。用玉米粉500 g，加10%酵母菌種稀釋液，再加水60%，混合均勻，使發(fā)酵混合物的含水量達(dá)75%，密封放保溫箱中密封培養(yǎng)56～60 h，溫度在28～30℃，發(fā)酵好后，采用45℃低溫鼓風(fēng)干燥，粉碎制成粉狀物，低溫冷凍保存待用。

紅曲霉復(fù)合制劑的制備：把中藥提取的混合物20%和蒸熟的大米80%混合均勻，裝入250 ml三角瓶?jī)?nèi)，厚度控制在8～10 cm左右，0.1 MPa、121℃高壓蒸汽滅菌30 min。在超凈工作臺(tái)中自然揮發(fā)水分。再配0.2%冰乙酸稀釋紅曲菌種，將其接種于裝有培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)溫度32℃，恒溫培養(yǎng)14～20 d。將培養(yǎng)好的菌塊倒入塘瓷器皿中放入45～50℃低溫烘干18～24 h，取出，粉碎，低溫冷凍保存待用。

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)動(dòng)物選用360只400日齡、健康無病、體況、產(chǎn)蛋率均相近的海蘭褐蛋雞，由吉林省龍井市鴻升養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧配方

本試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將360只海蘭褐蛋雞隨機(jī)分為4組，每個(gè)組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只蛋雞。飼養(yǎng)試驗(yàn)分為預(yù)飼期和正式期兩部分，預(yù)飼期為7 d，正式試驗(yàn)45 d。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，A組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.25%紅曲合生元+0.25%的酵母，B組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5%的酵母，C組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5%的紅曲合生元。試驗(yàn)蛋雞基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 蛋雞的飼養(yǎng)管理

在同一環(huán)境下，將蛋雞用階梯式方式飼養(yǎng),每籠3只雞，每天飼喂3次。每個(gè)雞舍由專人飼養(yǎng),采用自然通風(fēng)為主的方式，每日光照15～16 h。舍內(nèi)按期進(jìn)行常規(guī)消毒，防疫程序同生產(chǎn)要求。每天記錄好試驗(yàn)所需數(shù)據(jù)，并觀察其健康、發(fā)病及糞尿情況。

1.4 血清、肝臟和雞蛋采樣及抗氧化能力的測(cè)定

1.4.1 血清、肝臟和雞蛋采樣

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

血清采樣：試驗(yàn)?zāi)┢?于清晨未進(jìn)食前,隨機(jī)從每組抓取6只雞。用一次性采血管在翅靜脈處采8 ml。將血樣在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)靜置30 min，隨后用離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min,取血清樣本，-20℃環(huán)境下保存待用。

肝臟采樣：在試驗(yàn)期結(jié)束的前1 d早晨使供試蛋雞空腹，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每重復(fù)隨機(jī)選2只雞屠宰取肝臟樣，用編號(hào)的自封袋裝好，-30℃冷凍保存。

雞蛋采樣：試驗(yàn)期最后1 d，每個(gè)處理組的各個(gè)重復(fù)均隨機(jī)選取10枚雞蛋，冰箱內(nèi)4℃恒溫保存，備測(cè)各項(xiàng)雞蛋品質(zhì)指標(biāo)。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

肝臟組織內(nèi)GSH-Px、MDA、SOD的測(cè)定：各指標(biāo)檢測(cè)均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

蛋黃內(nèi)GSH-Px、SOD的測(cè)定：準(zhǔn)確量取新鮮蛋黃5 g，按1∶4比例加入無水乙醇，漩渦震蕩3 min，充分混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清待測(cè)。與肝臟組織內(nèi)GSH-Px、SOD的測(cè)定相同。

蛋黃內(nèi)MDA的測(cè)定:準(zhǔn)確量取新鮮蛋黃5 g，按1∶4比例加入生理鹽水，漩渦震蕩3 min，充分混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清待測(cè)。用試劑盒測(cè)MDA。測(cè)試試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

血清中GSH-Px、MDA、SOD的測(cè)定：與肝臟組織內(nèi)GSH-Px、MDA、SOD的測(cè)定相同。

1 .5 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄與整理，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋雞血清抗氧化指標(biāo)的影響(見表2)

由表2可看出，紅曲霉-中藥合生元制劑添加(A組)、酵母菌-中藥紅曲霉混合制劑添加組(B組)和酵母菌制劑添加組(C組)與對(duì)照組相比，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力都有了明顯的提高，丙二醛的含量均有所下降，但紅曲霉-中藥合生元制劑添加組(A組)、酵母菌-中藥紅曲霉混合制劑添加組(B組)較其他兩組改善更加明顯，與對(duì)照組相比超氧化物歧化酶含量分別提高了24.29%和31.59%(P＜0.05)，谷胱甘肽過氧化物酶含量分別提高了20.12%和18.21%(P＜0.05)，總抗氧化能力分別提高了61.80%和58.60%(P＜0.05)，丙二醛含量3個(gè)試驗(yàn)組比對(duì)照組分別下降了7.52%、12.68%和8.26%(P＜0.05)。

表2 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.2 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(見表3)

由表3可看出，紅曲霉-中藥合生元制劑添加組(A組)、酵母菌-中藥紅曲霉混合制劑添加(B組)和酵母菌制劑添加組(C組)與對(duì)照組相比，肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性都有了明顯的提高，丙二醛含量均有所下降，其中紅曲霉中藥合生元制劑添加組(A組)、酵母菌-中藥紅曲霉混合制劑添加組(B組)與對(duì)照組相比超氧化物歧化酶含量分別顯著提高了6.29%和3.41%(P＜0.05)，三個(gè)試驗(yàn)組谷胱甘肽過氧化物酶活性分別顯著提高了13.5%、12.71%和10.21%(P＜0.05)，丙二醛含量分別下降了16.13%、29.03%和17.74%(P＜0.05)。

表3 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋雞肝臟抗氧化性能的影響

2.3 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋黃中抗氧化指標(biāo)的影響(見表4)

由表4可看出，與對(duì)照組相比，紅曲霉-中藥合生元制劑添加組（A組）、酵母菌-中藥紅曲霉混合制劑添加組（B組）的超氧化物歧化酶活性分別提高了14.57%(P＜0.05)和17.29%(P＜0.05)、谷胱甘肽過氧化物酶活性分別提高了 6.21%(P＜0.05)和 6.63%(P＜0.05)、總抗氧化能力分別提高了39.73%(P＜0.05)和40.02%(P＜0.05)，丙二醛含量3個(gè)試驗(yàn)組比對(duì)照組分別下降了36.4%、34.44%和22.66%(P＜0.05)。

表4 酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑對(duì)蛋雞蛋黃抗氧化性能的影響

3 討論

自由基的存在會(huì)破壞機(jī)體組織、細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和脂類的性能,在機(jī)體內(nèi)導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生（Wolf R，1998）。超氧化物歧化酶是自由基的清除劑，其存在范圍較廣，在動(dòng)植物中起到關(guān)鍵的抗氧化作用（張笑天等，2014）。所以提高蛋雞機(jī)體內(nèi)SOD的活性可以使蛋雞提高自身免疫力,同時(shí)可以有效降血脂、膽固醇，進(jìn)而改善肝腎功能等。谷胱甘肽過氧化物酶是蛋雞體內(nèi)分解酶的一種，其作用較為重要，主要是催化谷胱甘肽的反應(yīng)，生成毒性相對(duì)較低的產(chǎn)物，從而減少過氧化物對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷（鄧萍等，2012）。這表明SOD和GSH-Px在機(jī)體內(nèi)起著較積極的作用。丙二醛是過氧化反應(yīng)的分解終產(chǎn)物（左兆云等，2011）。經(jīng)過蛋雞體內(nèi)反應(yīng)而產(chǎn)生的丙二醛,會(huì)導(dǎo)致膜脂、膜蛋白交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，最終影響細(xì)胞發(fā)揮其作用（Marvin等，1994）。所以，丙二醛的量可直接反應(yīng)出脂質(zhì)過氧化物的含量,也就是蛋雞脂質(zhì)損害的程度（劉偉，1997）?？偪寡趸芰κ强寡趸芰Φ暮饬繕?biāo)準(zhǔn)之一，其數(shù)值反應(yīng)了機(jī)體的總抗氧化能力（謝全喜等，2014）。綜上所述，這些酶促體系的相互聯(lián)系和作用，可以有效地清除自由基、過氧化氫等活性氧，同時(shí)可以停止產(chǎn)生自由基的一系列反應(yīng)。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)中草藥添加飼料可以提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的研究有很多。Zhang G.F.等（2009）研究表明，在雞飼料中添加不同粉碎程度的生姜可以顯著增加血液中TSOD和GSH-Px活性。楊宏斌等（2006）研究表明，黨參復(fù)方制劑可以清除超氧化陰離子，調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，提高抗病性。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紅曲霉-合生元試驗(yàn)組的GSHPx活性明顯比對(duì)照組高，MDA含量明顯比對(duì)照低,表明酵母-紅曲霉復(fù)合制劑可以提高蛋雞體內(nèi)抗氧化能力，改善腸道結(jié)構(gòu)，提高蛋雞的抗病性，進(jìn)一步延長(zhǎng)產(chǎn)蛋周期，延緩其衰老。其中肝臟中的SOD含量下降可能是在測(cè)量問題等環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題。據(jù)王翠菊等(2011)研究表明，適量的黃芪多糖可增加蛋雞體內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶的活性,并且可以減少蛋雞體內(nèi)丙二醛的含量。董秀梅等(2004)報(bào)道，復(fù)合微生態(tài)制劑能提高肉雞機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽過氧化酶、超氧化物歧化酶的活性,降低機(jī)體內(nèi)丙二醛的含量，提高抗氧化能力。張?chǎng)蔚龋?015）研究表明，從分子研究角度測(cè)試分析了微生態(tài)制劑對(duì)超氧化物歧化酶T-SOD在血清中的活性及SOD1、SOD2的mRNA表達(dá)量影響，發(fā)現(xiàn)可以提高蛋雞血清和肝臟的抗氧化能力，與本次試驗(yàn)的結(jié)果大致相同。

4 結(jié)論

酵母菌-紅曲霉復(fù)合制劑均可以提高蛋雞血清、肝臟及蛋黃中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力，而丙二醛的活性均降低，此類制劑在蛋雞生產(chǎn)上有延緩蛋雞生產(chǎn)期作用,具有一定的推廣價(jià)值。