■張 麗 丁宏標

(中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081)

酵母培養(yǎng)物含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，通過自身所含的活性成分調(diào)節(jié)宿主免疫功能、改善胃腸道營養(yǎng)與菌群平衡，對宿主產(chǎn)生有益的生理作用。其應(yīng)用從反芻動物到單胃動物以及水產(chǎn)動物，都有較好的生產(chǎn)效果，尤其是反芻動物應(yīng)用最多[1-2]。在酵母培養(yǎng)物的研制過程中，產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣主要是由菌種性能的好壞決定的。如今，市面上可用于酵母培養(yǎng)物制作的酵母菌種很多，由于不同種屬間菌種性能差異巨大，同種屬不同菌株間也存在較大差異，其對瘤胃發(fā)酵和動物機體產(chǎn)生不同效應(yīng)[3]。因此，優(yōu)良的酵母菌株是酵母培養(yǎng)物研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)。在興起的微生態(tài)制劑研究領(lǐng)域，人們重視作用機理的研究和作用效果的對比，但對菌株的選擇和性能比較未做過多的研究。

神曲又稱六神曲，是由面粉或麩皮和五種中藥在自然條件下發(fā)酵而成的一種曲類中藥。它是應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)中藥之一，也是中國藥典中最早被記錄的藥物之一，主要用于治療消化不良、嘔吐、腹瀉等癥狀[4]。酸面團是一種民間傳統(tǒng)的饅頭面團發(fā)酵劑，也用作發(fā)酵黃酒等酒曲，是由谷物、水和具有活性的微生物（酵母菌和乳酸菌）經(jīng)自然發(fā)酵而成。這兩種傳統(tǒng)曲劑均是活菌培養(yǎng)物，微生物群落多樣，且都含有制備酵母培養(yǎng)物的菌種，即釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。目前，未曾有研究表明神曲和酸面團中的酵母菌株對動物生產(chǎn)是否有積極的作用效果。

本文從傳統(tǒng)神曲和酸面團中分離出兩株釀酒酵母，結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工藝制備一種酵母培養(yǎng)物，并將其應(yīng)用到仔豬生產(chǎn)中，探索其對仔豬生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)利用和糞便微生物的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白胨（奧博星）、葡萄糖（北京化工）、酵母提取物（奧博星）、瓊脂（奧博星）、麥芽汁培養(yǎng)基（奧博星）、MRS瓊脂培養(yǎng)基（奧博星）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（奧博星）、神曲和酸面團購買于市面。DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、三目生物顯微鏡（NiKON）、LX-B35 L型立式高壓蒸汽滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離鑒定

將神曲和酸面團各10 g分別加入200 ml YPD液體培養(yǎng)基中，無菌條件下30℃培養(yǎng)24 h后，搖勻，用無菌生理鹽水梯度稀釋，選取10-6、10-7、10-83個稀釋度，準確吸取0.1 ml稀釋液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別從兩種曲劑中挑取一種類似釀酒酵母的典型單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24 h后劃線分離2～3次，將純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)YPD固體斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后，置于4℃低溫冰箱保藏。從神曲和酸面團分離到的菌種分別標記為SY和JY。將分離到的菌種進行分子鑒定，確定菌種。

1.2.2 菌種ITS區(qū)序列分析

以制備的總 DNA為模板，以引物 ITS1(5’-TCC?GTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCT?TATTGATATGC-3’)擴增菌株，50 μl PCR 體系重復(fù)3 管。PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、MgCl24 μl、引物（10 μM）各1 μl、模板DNA 40～50 ng、Ex Tag（Takara，大連）1.5 U、滅菌超純水補齊至50 μl。擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物以DL2000為分子質(zhì)量標準，在1.5%瓊脂糖凝膠，120 V電壓條件下電泳20 min檢測，并送往北京市生化鑒定中心進行序列分析。

1.2.3 酵母培養(yǎng)物制備

利用YPD培養(yǎng)基分別接種兩環(huán)純化好的兩種菌株于液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h，得種子液。然后按照5%的添加量，將兩種種子液分別添加到麥芽汁培養(yǎng)基中進行液體有氧發(fā)酵，30℃、200 r/min搖床發(fā)酵24 h。最后按10%的添加量將兩種發(fā)酵液，以1∶1的比例，添加到由麩皮、面粉和豆粕等組成的固體培養(yǎng)基中混勻，密封瓶口，放于30℃靜置發(fā)酵48 h。將所制得的酵母培養(yǎng)物均勻散于瓷盤中，放于室溫，自然風干。粉碎過40～60目篩，即為復(fù)合酵母培養(yǎng)物。含酵母菌數(shù)4×106CFU/g、酒石酸9.6 mg/g、蘋果酸5.8 mg/g、檸檬酸5.6 mg/g。

1.2.4 YC對保育豬生長性能的影響

選擇健康、平均體重為（15.7±0.26）kg的“杜×長×大”三元雜交生長豬90頭，按體重、性別基本一致的原則隨機分為2組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭。對照組（control）飼喂基礎(chǔ)日糧；酵母培養(yǎng)物組（YC）飼喂基礎(chǔ)日糧+5 g/kg YC，試驗期為35 d。測定指標有平均日增重、平均日采食量、料重比、腹瀉率、養(yǎng)分消化率以及糞便微生物。試驗采用的基礎(chǔ)日糧為參照NRC（1998）配制的粉狀飼料，飼料的常規(guī)原料根據(jù)豬場實際情況而定，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗豬舍為封閉、半漏縫地板式。試驗豬按豬場常規(guī)程序進行免疫、驅(qū)蟲、消毒和管理等，自由采食和飲水。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件的one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，以Duncan's法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 酵母菌的分子鑒定

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

以制備的總DNA為模板，以真菌ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4作為上下游引物，擴增菌株ITS區(qū)片段，PCR電泳檢測結(jié)果見圖1。將擴增的PCR產(chǎn)物送至北京市生化鑒定中心進行分子鑒定，在NCBI-Gen?Bank數(shù)據(jù)庫中，應(yīng)用BLAST工具與已登陸的酵母DNA序列進行比對。結(jié)果顯示，待測菌株與標準模式菌株的同源性均在99%以上，SY和JY GenBank登錄號分別為KJ729284.1和AM262831.1。

圖1 兩株酵母菌PCR擴增

2.2 YC對保育豬生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和糞便微生物的影響（見表2、表3、表4）

表2 YC對仔豬生長性能的影響

表3 YC對仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響(%)

表4 YC對仔豬糞便微生物的影響[lg(CFU/g)]

試驗結(jié)果表明，在仔豬日糧中添加YC可提高平均日增重7.2%，提高平均日采食量1.74%，降低料重比5.45%(P＞0.05)。顯著提高了仔豬對能量和干物質(zhì)的消化率(P＜0.05)，對有機物、粗蛋白、粗脂肪以及磷消化低于對照組(P＞0.05)，而中性洗滌纖維和鈣的消化則顯著低于對照(P＜0.05)。且顯著增加腸道乳酸菌數(shù)量和降低大腸桿菌數(shù)量，從而使仔豬腹瀉率極顯著降低(P＜0.01)。

3 討論

3.1 酵母培養(yǎng)物的制備

現(xiàn)代用于制備酵母培養(yǎng)物的主要菌種為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其來源主要通過篩選或基因工程獲得優(yōu)良品種。研究表明，傳統(tǒng)中藥神曲中含有大量的霉菌、細菌以及酵母菌，傳統(tǒng)酸面團中主要菌種為酵母和乳酸菌[5-6]。本試驗從市售的神曲和酸面團中，通過分子鑒定獲得兩株釀酒酵母。中國傳統(tǒng)自然發(fā)酵制得的神曲和酸面團與現(xiàn)代酵母培養(yǎng)物有相同之處，均是由谷物、水和微生物在一定條件下發(fā)酵而成。但傳統(tǒng)神曲和酸面團都是自然條件下發(fā)酵而成，環(huán)境中微生物均參與發(fā)酵，群落復(fù)雜多樣，造成質(zhì)量參差不齊。酵母培養(yǎng)物則是將特定菌種接種于特制培養(yǎng)基中，經(jīng)過特定的現(xiàn)代發(fā)酵工藝進行優(yōu)化發(fā)酵而成，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，且效果穩(wěn)定。利用現(xiàn)代發(fā)酵工藝，將傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)生的菌種進行最優(yōu)化處理，使其發(fā)揮最大優(yōu)勢，可能是探索新型酵母培養(yǎng)物的一條途徑。

3.2 YC對仔豬生長性能的影響

YC含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)以及促生長因子，許多研究已證實，YC可以提高斷奶仔豬的生長性能。Mathew[7]等研究表明，日糧添加YC有助于提高斷奶仔豬的ADG和ADFI。本實驗表明YC組，對仔豬平均日增重及采食量沒有顯著變化(P＞0.05)，僅比對照組分別提高了7.2%和1.74%。但顯著減少了仔豬的腹瀉率(P＜0.01)。這與 van der Peet-Schwering等[8]研究結(jié)果相一致。原因可能是當時環(huán)境、日糧等對仔豬的免疫機能造成影響而導(dǎo)致的。van Heugten等[9]研究解釋了動物在高疾病應(yīng)激下，YC可能會通過觸發(fā)腸道免疫應(yīng)答與免疫系統(tǒng)的相互作用而使吸收的能量向免疫功能方向流動，非生長方向。

3.3 YC對仔豬養(yǎng)分消化率的影響

E.Pinloche等[10]表示在生長豬飼糧中添加YC，能刺激其后腸的發(fā)酵，使揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和細菌發(fā)酵終產(chǎn)物增加，從而提高豬的養(yǎng)分利用率。Y.B.Shen等[11]研究表明，YC可顯著提高斷奶仔豬對CP、干物質(zhì)、能量的消化率(P＜0.05)，鈣、磷的消化率則不顯著(P＞0.05)。本試驗研究結(jié)果證實，YC對總能和干物質(zhì)消化率顯著高于對照組(P＜0.05)，對有機物、粗蛋白、粗脂肪以及磷消化低于對照組(P＞0.05)，而粗纖維和鈣的消化則顯著低于對照(P＜0.05)。這與前人研究結(jié)果有相同之處，亦有不一致的效果。這也可能是由于菌劑、日糧、品種等不同造成的。

3.4 YC對仔豬糞便微生物的影響

微生態(tài)制劑的主要目的是向動物機體植入外源益生菌或改善其內(nèi)源菌群，從而達到促生長的效果。本實驗結(jié)果顯示，YC能顯著減少仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量和增加乳酸菌菌數(shù)(P＜0.05)，且兩者比值也顯著比對照組降低(P＜0.05)，這與 Aditya Upadrasta等[12]研究結(jié)果一致。可能與日糧引起的應(yīng)激有關(guān)，YC中酵母多糖抑制有害菌對腸道定植，且其中含的營養(yǎng)物質(zhì)為腸道有益菌繁殖提供強大的動力，從而改善胃腸環(huán)境。但是YC組生長性能未見顯著提高，這也驗證了Scheurmann等[13]的研究結(jié)論，即活菌制劑對腸道微生物菌群平衡的改善作用不一定能反映在生產(chǎn)性能上。

4 結(jié)論

從傳統(tǒng)曲劑神曲和酸面團中分離得到的兩株酵母菌種，經(jīng)分子鑒定確定為釀酒酵母，將其結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵工藝，制備一種酵母培養(yǎng)物。應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)中，表明該酵母培養(yǎng)物對仔豬生長性能有提高趨勢，可顯著增加日糧中總能和干物質(zhì)的消化吸收，且可顯著降低仔豬的腹瀉率，改善腸道微生物菌群。該新型復(fù)合YC對斷奶仔豬生長性能及腸道健康有一定效果，為微生態(tài)制劑發(fā)展提供了幫助。