■丁素娟 王薇薇 李愛科 周 航 王永偉 王 麗 宋 丹 方 俊

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

動物腸道內(nèi)約有30個屬達(dá)500余種細(xì)菌，主要為厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，其中專性厭氧菌達(dá)99%以上。腸道微生物大致可以分為三大類，第一類是有益菌，它是機(jī)體不可缺少的益生菌，主要是各種雙歧桿菌、乳酸桿菌等；第二類是有害菌，這類菌達(dá)到一定的數(shù)量就會致病；第三類是具有雙重作用的中性菌，這類菌在正常情況下是有益的，一旦增殖失控或從腸道轉(zhuǎn)移到身體其他部位，可能會致病，如大腸桿菌、腸球菌等。按照黏附性分類，可分為黏附菌和過路菌。黏附菌是指能在機(jī)體腸道內(nèi)定植一定時間的細(xì)菌，發(fā)揮重要的生理作用。過路菌一般屬于腸道內(nèi)的次要菌群，流動性大，具有潛在的致病性，有的潛在致病。黏附是微生物定植于宿主腸道上皮過程中的第一步。益生菌只有黏附于宿主腸道上皮細(xì)胞上，才能保證其在宿主腸道內(nèi)長期發(fā)揮作用。在腸道中定植的有益菌起著維持腸道微生態(tài)平衡的作用，有利于減少腹瀉、炎癥的發(fā)生，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)。然而，致病菌也只有在黏附于腸道后，才能在局部產(chǎn)生毒素或者直接侵入到組織內(nèi)引起宿主不適，致病菌黏附于細(xì)胞表面是其入侵人體并感染其致病的第一步，繼而引起宿主細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的變化，從而引發(fā)疾病癥狀。細(xì)菌細(xì)胞黏附定植于宿主腸上皮細(xì)胞是長期進(jìn)化的結(jié)果，具有一定特異性。

外源的益生菌能否在腸道黏附和定植是評價益生菌制劑效果的主要指標(biāo)之一。細(xì)菌的黏附性受很多因素的影響，如溫度、pH值、菌液濃度等。研究黏附的理論意義在于了解原核生物和真核生物之間初始相互作用，預(yù)防致病菌的感染，評價和促進(jìn)益生菌制劑的益生效果等。

1 黏附機(jī)制

細(xì)菌的黏附是一個復(fù)雜的過程，涉及到許多因素，如菌株的差異、細(xì)胞壁表面組成和環(huán)境因素。有報道稱細(xì)菌素對菌株在腸道內(nèi)的定植及與腸道內(nèi)其他菌株競爭有優(yōu)勢，而且Bove等也曾從基因表達(dá)方面證實這一說法。細(xì)菌對細(xì)胞的黏附分為兩個階段，可逆的非特異性黏附階段，以及特異的黏附階段[6]。一般所指的黏附是細(xì)菌的特異性黏附，它是微生物表面黏附素與細(xì)菌表面或黏液中特異性受體共同完成，即黏附素-受體學(xué)說。

1.1 非特異性黏附機(jī)理

細(xì)菌的非特異性黏附是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程，此過程是可逆的，在液體震蕩或沖洗中被洗脫，對去污劑很敏感。黏附的強(qiáng)弱主要由菌體表面的疏水性和表面電荷有關(guān)。細(xì)菌表面的疏水性取決于細(xì)菌表面非極性殘基的分布，它的強(qiáng)弱決定了細(xì)菌的范德華力的大小，細(xì)菌表面所帶的電荷決定了靜電排斥，細(xì)菌和黏附對象界面間存在著這兩種力。當(dāng)細(xì)菌表面具有較高的疏水性和低靜電力，范德華力就會消弱靜電荷排斥力，從而細(xì)菌和界面發(fā)生黏著。

有研究表明，細(xì)菌的黏附與細(xì)菌的自動聚集及共聚集有關(guān)，是許多病原體定植和感染胃腸道的先決條件。益生菌與致病菌的共聚取代致病菌之間的共聚，這種共聚對腸道菌群的異常具有調(diào)節(jié)作用，這也是益生菌的益生性之一。與致病菌競爭黏附位點、營養(yǎng)源。有研究結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌M92的黏附能力與其自動聚合能力之間存在相關(guān)關(guān)系，這可能與細(xì)菌表面的蛋白有關(guān)。

1.2 特異性黏附機(jī)理

在非特異性黏附的基礎(chǔ)上，細(xì)菌的黏附進(jìn)入特異性黏附階段，這階段主要是細(xì)菌表面的黏附素對腸上皮細(xì)胞或黏液中的黏附受體進(jìn)行特異性的結(jié)合。黏附素是細(xì)菌表面的一類生物大分子，通常為蛋白質(zhì)或糖蛋白，存在于細(xì)胞壁、外膜蛋白、菌毛、鞭毛和微毛等結(jié)構(gòu)中，細(xì)菌可通過黏附素附著在宿主細(xì)胞上，對細(xì)菌定植起著重要的作用。黏附素的種類因菌種不同而異，也隨同種的不同菌株而別，通常一種細(xì)菌只含一種黏附素，但有些種屬細(xì)菌或個別菌株能同時表達(dá)兩種或更多種黏附素。但黏附素的種類因菌種的不同而存在差異，在同種不同菌株之間也存在著差異，一般一種細(xì)菌只含一種黏附素，但有些種屬細(xì)菌或同種的個別細(xì)菌能同時表達(dá)兩種或更多種黏附素。黏附除了具有菌株特異性，宿主也具有特異性，可能與凝集素和糖脂或糖蛋白的相互識別有關(guān)。從一種宿主腸道內(nèi)分離的菌株不一定就能黏附于另一種宿主腸道內(nèi)，反之亦然。

2 幾種益生菌的黏附研究

益生菌的黏附能夠保護(hù)宿主胃腸道健康，具有抑制病原菌的入侵和感染等重要生理功能，是胃腸道的一道天然屏障，因此黏附是益生菌的一種重要的益生特性。菌株的黏附能力也具有種屬特異性，很多的學(xué)者對不同菌種的黏附能力和黏附機(jī)制進(jìn)行了研究，包括乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌等。

2.1 乳酸菌

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱。大多為厭氧或兼性厭氧菌，廣泛地存在于畜、禽腸道，許多食品，物料及少數(shù)臨床樣品中。乳酸菌對宿主腸道的黏附性是其作為益生素的重要指標(biāo)之一。大量實驗表明，黏附性強(qiáng)的乳酸菌被機(jī)體攝入后黏附于腸道上皮細(xì)胞，黏附性較弱的會隨著腸道的蠕動排出體外，表1為不同乳桿菌對不同細(xì)胞模型的黏附性。俞涵麗的實驗結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌活菌體和熱滅活菌體都能很好地黏附到IPEC-J2細(xì)胞上，并且這兩種狀態(tài)的嗜酸乳桿菌能抑制大腸桿菌對IPEC-J2細(xì)胞的黏附；劉祥通過研究乳酸桿菌對胃上皮細(xì)胞的黏附，結(jié)果表明，乳桿菌WR22在活菌和死菌的狀態(tài)下都能大量黏附于胃上皮細(xì)胞，并且能顯著降低幽門螺旋桿菌在菌胃上皮細(xì)胞的黏附密度；MaréL等利用熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）植物乳桿菌423和唾液乳桿菌241對仔豬腸道的黏附性研究,其結(jié)果表明植物乳桿菌423和唾液乳桿菌241能黏附于腸道各個地方，這取決于仔豬的年齡，此外植物乳桿菌素423可能抑制糞腸球菌。乳酸菌是研究較早的益生菌，其在腸道內(nèi)的成功定植能減少機(jī)體受到致病菌的侵?jǐn)_，維持腸道內(nèi)微生態(tài)的相對穩(wěn)定，體內(nèi)實驗證明乳酸菌的成功定植能減少仔豬腹瀉。

乳桿菌屬為無芽孢革蘭氏陽性菌，是乳酸菌中種類最多的種群，是目前商業(yè)上應(yīng)用廣泛的益生菌菌株。表2為2010年，國家衛(wèi)生部根據(jù)《食品安全法》及其實施條例的有關(guān)規(guī)定，制定的可用于食品的菌種名單中的可食用的乳桿菌名單。

乳桿菌具有許多益生功能，包括預(yù)防腹瀉和腸道感染、緩解炎癥性腸道疾病、抑制病原菌的生長等。益生性的乳桿菌發(fā)揮其益生功能的前提是他們必須在宿主腸道內(nèi)黏附并成功定植。有研究發(fā)現(xiàn)，豬源乳酸桿菌對致病性沙門菌、大腸埃希菌在仔豬小腸上皮細(xì)胞上存在競爭性黏附，其應(yīng)用能減少食物源性污染和提高食品安全。

鼠李糖乳桿菌GG耐胃酸和膽汁的能力優(yōu)于普通酸奶菌種，實驗表明，它能占據(jù)細(xì)胞表面的位置并分泌黏附素，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等微生物在腸黏膜和細(xì)胞上黏附。但活體組織切片證實，鼠李糖乳桿菌GG不論在體外還是在體內(nèi)均能黏附于腸道上皮細(xì)胞，但是定植時間不能長久。因為鼠李糖乳桿菌GG能引起免疫反應(yīng)，該反應(yīng)可阻止菌株的永久性定植。

表1 具有黏附性的乳桿菌

表2 可用于食品的乳桿菌屬名單

2.2 雙歧桿菌

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人類和動物腸道天然存在的一類厭氧微生物，主要定居于回腸和結(jié)腸，它伴隨宿主終生，無毒無害，具有拮抗病原微生物、調(diào)節(jié)免疫、合成B族維生素及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等益生性能，能以微生物制劑添加于藥品、食品及保健品中。然而，機(jī)體內(nèi)雙歧桿菌會隨著年齡、飲食、內(nèi)外環(huán)境的改變，以及生病或藥物作用等情況下，發(fā)生相應(yīng)的動態(tài)變化。雙歧桿菌分布在胃腸的數(shù)量隨年齡的增長而減少，尤其在母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道內(nèi)分布最多。嬰兒腸道內(nèi)的雙歧桿菌占總腸道菌的百分之六十，母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中雙歧桿菌占糞便微生物總數(shù)的98%，而60歲以上老人腸道內(nèi)的雙歧桿菌只占其總腸道菌的7.9%。

雙歧桿菌有32個亞型，含有雙歧桿菌的生物制劑多達(dá)70余種。雙歧桿菌是嚴(yán)格的厭氧菌，大量的有機(jī)酸不利于它的生長，存活時間短，而且不耐膽汁和胃酸，抗逆性差，為此選育優(yōu)良的菌株十分重要。荷蘭TNO研究所對幾百株雙歧桿菌做黏附試驗，結(jié)果只有20%左右的菌可以較好地黏附。表3為不同雙歧桿菌對不同細(xì)胞模型的黏附性。

表3 具有黏附性的雙歧桿菌

2.3 其他

黃正蔚等對致齲菌之一的黏性放線菌（Actinomyces viscosus）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)三七等傳統(tǒng)中藥能有效抑制黏性放線菌對唾液獲得性膜的早期黏附。有研究者發(fā)現(xiàn)中藥有效成分穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,AG)可能通過抑制白假絲酵母菌某些黏附基因的表達(dá)而抑制其早期黏附。武楠等通過構(gòu)建的原核表達(dá)裁體pQE30/Ace在大腸埃希菌M15中成功地表達(dá)，純化的重組Ace蛋白具有膠原黏附活性，發(fā)現(xiàn)Ace蛋白是一種與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)致病性密切相關(guān)的表面蛋白，具有良好的黏附活性，有望成為抗腸球菌感染治療的一個新靶位。對益生菌和致病菌黏附性的研究，有利于更好地控制致病菌對機(jī)體的傷害，維持機(jī)體健康。有研究者對從糞便中分離到的3株腸球菌進(jìn)行體外黏附性試驗，發(fā)現(xiàn)他們的黏附性低，平均在2.3個/細(xì)胞。

3 黏附的測定方法

目前測定黏附的方法有多種，各有各的優(yōu)缺點，根據(jù)實驗的需要選擇合適的方法很重要。黏附實驗用到的細(xì)胞模型，可根據(jù)細(xì)菌的來源或其他特性及我們應(yīng)用需要選擇合適的細(xì)胞模型或動物模型。

3.1 黏附實驗的細(xì)胞模型

細(xì)菌黏附實驗中用到的細(xì)胞模型主要有如Caco-2、HT29、IPEC-J2等細(xì)胞系，人類腸道細(xì)胞系被認(rèn)為可以代表體內(nèi)腸道環(huán)境，是經(jīng)常被使用的人類腸道細(xì)胞系，經(jīng)培養(yǎng)后可以形成具有極性的單層細(xì)胞，這種單層細(xì)胞與小腸上皮組織細(xì)胞非常相似。林雪彥等通過比較Caco-2 cell(腸道上皮細(xì)胞)、MDCK cell（犬腎細(xì)胞）、CEF(雞胚成纖維細(xì)胞)的黏附性，得出結(jié)論乳酸桿菌對結(jié)腸癌細(xì)胞系的黏附性與18日齡SPF雞胚分離培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞黏附性相似，這表明我們可以用結(jié)腸癌細(xì)胞系代替原代細(xì)胞進(jìn)行益生菌的黏附實驗測定。這些細(xì)胞系是由腸道癌組織誘導(dǎo)培養(yǎng)得來，與腸道上皮細(xì)胞非常相似。但是利用腸道上皮細(xì)胞研究黏附性并沒有涉及到宿主腸道上皮組織中廣泛存在的黏液層的作用。因此，也有人考慮以雛雞腸黏膜為模型、羅非魚腸囊模型等。

有些致病菌黏附于宿主細(xì)胞后可引起形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，例如腸致病性大腸桿菌能使細(xì)胞刷狀緣絨毛局部變性，胞膜形成杯狀結(jié)構(gòu)。而有益的雙歧桿菌黏附于細(xì)胞后沒有發(fā)現(xiàn)以上明顯變化。

3.2 體外黏附的檢測方法

體外黏附的檢測方法可分為直接檢測法和間接計數(shù)法，這些檢測法主要針對宿主或者細(xì)胞模型中細(xì)菌黏附的檢測。直接檢測法有顯微鏡計數(shù)法和平板計數(shù)法。其中，顯微鏡計數(shù)法，是對黏附后細(xì)菌進(jìn)行染色，在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，計算每平方毫米或每個細(xì)胞黏附的細(xì)胞數(shù)；而平板計數(shù)法常用于細(xì)菌對真核細(xì)胞或無生物活性表面的黏附檢測，對洗脫后的細(xì)菌稀釋到合適的倍數(shù)，固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，最后計算出細(xì)菌的數(shù)量。這兩種方法都不需要特殊的設(shè)備，操作簡單，但受主觀影響較大，重復(fù)性欠佳。

間接計數(shù)法有放射性同位素、熒光物質(zhì)、生物素或ELISA抗體標(biāo)記法等，這些方法相對來說靈敏度精確，減少主觀因素的影響，但耗時長、花費高。放射性同位素標(biāo)記中可以用到的同位素有H3、51Cr、I125及H3，首先對實驗菌進(jìn)行放射性標(biāo)記，后用液體閃爍儀進(jìn)行計數(shù)。而熒光標(biāo)記法與同位素法類似，主要指用異硫氰酸熒光素（FITC）對待測菌株進(jìn)行標(biāo)記，黏附試驗后，對洗脫液中的細(xì)菌進(jìn)行戊二醛固定，然后在熒光顯微鏡下觀察黏附的細(xì)菌數(shù)。抗體標(biāo)記法，有人利用Elisa技術(shù)測定細(xì)菌對細(xì)胞的黏附，并且與平板計數(shù)法及放射性同位素法進(jìn)行了比較，實驗結(jié)果表明，若想提高實驗的靈敏度，則需要提高抗體的質(zhì)量。

此外還有分光光度法，它的原理是利用染料對黏附在細(xì)胞或者黏液上的細(xì)菌進(jìn)行染色，然后通過黏附前后吸光值的變化來間接對黏附的細(xì)菌進(jìn)行計數(shù)。但這種方法需要細(xì)菌數(shù)量多，否則達(dá)不到分光光度計的檢測靈敏度。這種方法操作簡單，對實驗設(shè)備的要求較低，但是研究對象是有黏附力較強(qiáng)的細(xì)菌，且靈敏度較低。

3.3 體內(nèi)黏附的檢測方法

體內(nèi)黏附模型更能真實地反應(yīng)細(xì)菌在宿主腸道內(nèi)的黏附情況，體外模型中缺少了腸道上皮組織中廣泛存在的黏液層的作用。但是受目前試驗技術(shù)的限制，尚缺乏成熟的細(xì)菌體內(nèi)黏附評價標(biāo)準(zhǔn)。目前，運用普遍的是平板菌落計數(shù)法，平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取確定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。只能對黏附細(xì)菌進(jìn)行粗略的計數(shù)，誤差較大，無法排除宿主腸道內(nèi)本身存在的細(xì)菌對計數(shù)的影響。此外，還可以采用脈沖場電泳計數(shù)、熒光原位雜交等技術(shù)來檢測實驗菌株對腸道的黏附性，但這些方法的成本較高且技術(shù)含量高。MaréL等利用熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）研究益生菌對仔豬腸道的黏附性,其結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌能黏附于腸道的各個部位，這取決于仔豬的年齡，此外植物乳桿菌素423可能抑制糞腸球菌。有研究者將含熒光蛋白基因的質(zhì)粒倒入到大腸桿菌中，通過檢測腸道中其熒光強(qiáng)度來觀察大腸桿菌在腸道中的黏附情況，這種方法能實時檢測大腸桿菌在腸道中的位置及停留的時間，但是熒光蛋白在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定性欠佳，所以這種方法并沒有得到廣泛使用。

4 展望

動物剛出生時，腸道內(nèi)是無菌的，隨著與外界環(huán)境接觸，迅速形成一個非常多樣化的微生物群落。但同時，腸道內(nèi)的菌群數(shù)量會隨著年齡的增長而逐漸減少，因而攝入一定量的益生菌，并定植于動物腸道，可有效改善機(jī)體健康。我們可以通過添加微生物制劑，增加宿主體內(nèi)益生菌的含量及種類，增加他們在腸道中的黏附和定植，但前提是有足夠數(shù)量的活菌攝入。有研究表明，活性乳桿菌的攝入量只有在高于1×106cfu/ml時才能起到益生作用。況且益生菌非常脆弱，容易受到保存環(huán)境的影響而失去活性。以雙歧桿菌為例，雙歧桿菌是人體重要的益生菌，嚴(yán)格厭氧，存活時間短，且不耐膽汁和胃酸，抗逆性差。人體內(nèi)每天有2.5 L的胃酸和1 L膽鹽分泌進(jìn)入消化道。因此，微生物若想到達(dá)腸道且黏附于上皮細(xì)胞表面，需有耐受胃酸和膽汁的能力。益生菌經(jīng)微膠囊包被后，可有效抵御前段胃腸道消化液的消化作用，并在后腸道部分釋放出來起益生作用。但目前有關(guān)微膠囊包被益生菌在胃腸道內(nèi)緩釋后，在腸道上皮細(xì)胞上的黏附和定植尚無研究報道，仍需進(jìn)一步研究。且由于益生菌菌株的特異性、機(jī)體的特異性和益生效應(yīng)的評估標(biāo)準(zhǔn)不一，益生菌制劑的黏附于定植對腸道致病菌的實際抑制效果仍無法有效評價。因此，建立理想的黏附實驗?zāi)Ｐ秃头椒▽M(jìn)一步的試驗研究具有重要的意義。