黃連素抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及機(jī)制研究

李蕾,丁小青,周建業(yè),周衛(wèi)東,湯夏冰*

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214023)

摘要：目的探討黃連素對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的抑制作用及其可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，使用不同濃度黃連素誘導(dǎo)不同時(shí)間，應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期及凋亡；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法分別檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D(CyclinD)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與0 μmol/L黃連素對(duì)照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素作用Hep-2細(xì)胞24、48 h，可明顯抑制細(xì)胞增殖，且呈濃度時(shí)間依賴性(P<0.05)；2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素作用 Hep-2細(xì)胞48 h，細(xì)胞早期凋亡率明顯升高，呈濃度依賴性(P<0.05)；G0/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G0/G1期；10μmol/L黃連素作用Hep-2細(xì)胞48 h，Bax基因和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，CyclinD、Bcl-2基因和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論黃連素能抑制喉癌細(xì)胞增殖，引起G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與Bax基因表達(dá)上調(diào)及CyclinD、Bcl-2基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃連素；喉癌；細(xì)胞增殖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.004

中圖分類號(hào)：R767文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2015)06-1109-03

基金項(xiàng)目:南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金(2013NJMU161, 2013NJMU167)。

作者簡(jiǎn)介:李蕾(1986-)，女，碩士研究生，主要從事喉癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

收稿日期:(2015-04-20)

*通信作者:湯夏冰，電話-15861598912,電子信箱-txbny@sina.com

Berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells

LI Lei, DING Xiaoqing, ZHOU Jianye, ZHOU Weidong, TANG Xiabing*

(Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi 214023,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of berberine on proliferation of human laryngeal Hep-2 carcinoma cells and its possible mechanism. MethodsThe Hep-2 cells were treated with different concentrations of berberine for different hours, the proliferation inhibitory rates were detected by MTT assay; the cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry; the levels of CyclinD, Bcl-2 and Bax were measured by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation inhibition rates of Hep-2 cells treated with 2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L berberine for 24 and 48 hours were increased compared with 0μmol/L group in concentration-and time-dependent manners (P<0.05). The early apoptotic rate was increased in concentration-dependent manner (P<0.05), and the proportion of cells in G0/G1 phase was increased after treated with 2.5, 5.0, 10.0 μmol/L berberine for 48 hours (P<0.05). The levels of Bax mRNA and protein expression significantly increased (P<0.05), while the levels of CyclinD and Bcl-2 expression significantly decreased (P<0.05). ConclusionBerberine can inhibit proliferation, and induct cell cycle G0/G1 arrest and apoptosis of Hep-2 cells probably via upregulation of Bax and downregulation of CyclinD and Bcl-2 mRNA and protein expression.

Keywords:berberine; laryngeal carcinoma; cell proliferation

黃連素又稱小檗堿，屬于異喹啉類生物堿，是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)消炎及抗菌藥物。研究[1-12]表明，黃連素在肝癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等多種腫瘤中有抗癌作用。但在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以人喉癌Hep-2細(xì)胞作為研究對(duì)象，體外研究黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制，為黃連素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人喉癌細(xì)胞株Hep-2購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司；黃連素、MTT購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞周期、Annexin V-FITC、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)相關(guān)試劑購(gòu)自碧云天公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自TaKaRa公司，細(xì)胞周期蛋白D(CyclinD)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) PCR引物由TaKaRa公司合成。1.2細(xì)胞培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞株Hep-2使用含10% FBS MEM培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1.3MTT法分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔板中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素的完全培養(yǎng)液200 μL，每組藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加黃連素的對(duì)照組(含0.1% DMSO完全培養(yǎng)液)和不接種細(xì)胞的空白孔，分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫下振蕩10 min，使產(chǎn)生的結(jié)晶紫完全溶解。在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度值(OD值)。以空白孔調(diào)零。細(xì)胞增殖抑制率=[1-OD(實(shí)驗(yàn)組)/OD(對(duì)照組)]×100%。1.4細(xì)胞周期測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后加入無(wú)血清MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使之同步化，然后加入不同濃度2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，經(jīng)胰酶消化，吹勻的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，加入預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞，輕輕吹勻，4 ℃固定24 h。1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL按說(shuō)明書(shū)配制的碘化丙啶(PI)染色液，重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。以不加黃連素的細(xì)胞作為對(duì)照組。1.5細(xì)胞早期凋亡測(cè)定分組同細(xì)胞周期測(cè)定，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，吹勻細(xì)胞的細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，用PBS重懸細(xì)胞，取10萬(wàn)重懸的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC，混勻。室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入10 μL PI染色液，混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以不加黃連素的細(xì)胞作為對(duì)照組。1.6CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA水平檢測(cè)采用Real-time CR法檢測(cè)。按照 Trizol說(shuō)明書(shū)提取10.0 μmol/L黃連素作用后48 h細(xì)胞總RNA。根據(jù)Prime Script RT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。CyclinD上游引物為5’- CACGGCTCACGCTTACCTCA-3’，下游引物為5’-ACTTGCGCGTCACAGGACAG-3’； Bax上游引物為5’- TGCGTCCACCAAGAAGCTGA-3’，下游引物為5’-AACATGTCAGCTGCCACTCG-3’； Bcl-2上游引物為5’- CTTCAGAGACAGCCAGGAGA-3’，下游引物為5’-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3’；GAPDH上游引物為5’-AACGGATTTGGTCGTATTG- 3’，下游引物為5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-△△Ct表示各組 mRNA相對(duì)量。以不加黃連素的細(xì)胞作為對(duì)照組。1.7CyclinD、Bax、Bcl-2 蛋白水平檢測(cè)采用Western blot法檢測(cè)。用RIPA細(xì)胞裂解液裂解10.0 μmol/L黃連素作用后48 h細(xì)胞總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，根據(jù)Marker位置剪膜，分別加入兔抗人CyclinD、Bcl-2、Bax多克隆抗體、兔抗人β-actin 多克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，膠片顯影, 掃描膠片后用凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)光密度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平是各組光密度值與相應(yīng)β-actin光密度值的比值。以不加黃連素的細(xì)胞作為對(duì)照組。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響與0 μmol/L黃連素的對(duì)照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L黃連素作用24、48 h對(duì)Hep-2細(xì)胞的增殖抑制率均明顯升高(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度黃連素的增殖抑制率逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，黃連素抑制Hep-2細(xì)胞增殖呈濃度時(shí)間依賴性。2.2黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞周期和細(xì)胞早期凋亡的影響2.5、5.0、10.0 μmol/L黃連素作用Hep-2細(xì)胞48 h，與0 μmol/L黃連素的對(duì)照組比較，隨著黃連素濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞增多(P<0.05)，細(xì)胞阻滯于G0/G1期。 2.5、5.0、10.0μmol/L黃連素作用Hep-2細(xì)胞48 h，細(xì)胞的早期凋亡率分別為(1.73±0.15)%、(6.27±0.15)%、(13.2±0.20)%，與0 μmol/L黃連素的對(duì)照組(0.83±0.06)%比較，Hep-2細(xì)胞的早期凋亡率明顯升高(P<0.05)，呈濃度依賴性(P<0.05)。2.3黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞CyclinD、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響與0 μmol/L黃連素的對(duì)照組比較，10 μmol/L的黃連素作用48 h，Bax mRNA和蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。CyclinD、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1　黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的影響( ± s)

表1　黃連素對(duì)Hep-2細(xì)胞Cyclin D、Bcl-2、Bax mRNA 表達(dá)的影響( ± s)

組 別CyclinDBcl-2Bax10μmol/L黃連素組0.49±0.02#0.71±0.02#1.65±0.10#對(duì)照組 1.00±0.05 1.00±0.06 1.00±0.05

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05

3討論

本研究顯示，黃連素對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈濃度時(shí)間依賴性。黃連素能影響Hep-2細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制和合成，抑制細(xì)胞的正常分裂，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，從而使Hep-2細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。黃連素作用Hep-2細(xì)胞的早期凋亡率也升高，且呈濃度依賴性，說(shuō)明黃連素可通過(guò)細(xì)胞促進(jìn)周期阻滯和抑制凋亡從而抑制細(xì)胞的增殖。黃連素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[13-15]。 Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡中起著重要作用。Bcl-2主要通過(guò)與Bax形成二聚體發(fā)揮作用，二者的比例決定細(xì)胞發(fā)生凋亡與否。CyclinD是調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)分裂增殖的關(guān)鍵周期蛋白，其檢測(cè)出來(lái)的含量能初步反映整個(gè)細(xì)胞群的增殖活躍的程度。筆者通過(guò)對(duì)黃連素抑制喉癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)黃連素上調(diào)了促凋亡蛋白Bax的基因和蛋白水平，下調(diào)了周期蛋白CyclinD、抗凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白水平。 綜上所述，黃連素作為一種天然的中藥提取物，對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖有抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2及CyclinD蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)凋亡有關(guān)。黃連素對(duì)喉癌細(xì)胞的抑制作用可能還體現(xiàn)在遷移、侵襲等方面，有待進(jìn)一步研究中。黃連素有望成為治療喉癌的有效化療藥物。

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