崔海英 周 慧 張雪婧 趙呈婷 李 偉 林 琳

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

近年來(lái)，人們對(duì)于綠色安全越來(lái)越關(guān)注，對(duì)新型植物源或動(dòng)物源性質(zhì)的殺菌抗菌物質(zhì)的研究也愈加重視［1］。植物型抗菌劑因其毒副作用小而越來(lái)越受到喜愛(ài)。利用植物提取抗菌材料，并添加到食品或化妝品中，可以在抗菌的同時(shí)確保它們的安全性［2］。植物源的天然香辛料，具有香、辛、麻、辣、苦、甜等滋味，它不僅能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味，還能夠提高和改善食品的風(fēng)味，抑制和矯正食品中不良的氣味，突出食品典型風(fēng)味特征，使食品風(fēng)味協(xié)調(diào)［3］。天然香辛料的殺菌防腐功能很早就已經(jīng)被人發(fā)現(xiàn)并加以利用，因此香辛料越來(lái)越受到人們更加廣泛的喜愛(ài)。國(guó)內(nèi)外對(duì)香辛料的研究由來(lái)已久，日本［4］曾研究將芥子精油加入塑料制成食品包裝材料，用于替代化學(xué)防腐劑保存食品。江旺等［5］研究了香辛料精油對(duì)油料花生氣相防霉的作用。叢健民等［6］研究了香辛料提取物對(duì)草莓的保鮮研究。張璟晶［7］研究了天然香辛料的抑菌作用以及對(duì)冰鮮銀鯧的保鮮效果。目前對(duì)香辛料提取物抗菌性的研究多集中在單個(gè)提取物抑菌性的研究，對(duì)多種提取物復(fù)配的抑菌性的研究還不多見(jiàn)［8］。本試驗(yàn)擬利用多種具有抗菌性能的天然香辛料植物提取液來(lái)配制天然植物型抑菌劑，并對(duì)其在草莓上的保鮮作用進(jìn)行研究。此類抑菌劑是由純天然的香辛料植物提取液配制而成，可直接作用于物品、食品甚至人體，可為人們的日常生活中提供自然、健康、無(wú)害、有效的抑菌與保鮮制劑［9］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物原料

甘草:迷迭香購(gòu)于奧淼中藥材有限公司;

豆蔻、肉桂、百里香、意大利蠟菊、貫葉連翹:市售。

1.1.2 參試菌種及培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichia coli IFO 3301)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus 30179)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Enteritidis B11)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia ATCC 13883)、枯草芽孢桿菌(Bacillus cereus IFO 3457):江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院;

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉20 g/L;

普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，氯化鈉5 g/L。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋:MLS-3020型，鳥取三洋電機(jī)(廣州)有限公司;

生化培養(yǎng)箱:LRH-250型，上海恒一科技有限公司;

水浴恒溫振蕩器:SHA-B型，江蘇金壇市中大儀器廠;

全溫空氣搖床:QYC-200型，上海?，斣囼?yàn)設(shè)備有限公司;

高分辨透射電子顯微鏡:JEM-2100(HR)型，日本電子株式會(huì)社;

熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡:JSM-7001F型，日本電子株式會(huì)社。

1.2 植物提取液的配制

稱取百里香、甘草、肉桂等7種參試香辛料各10 g分別置于容積相同的不同廣口瓶中，分別加入90 mL無(wú)水乙醇。將廣口瓶密封后置于水浴恒溫振蕩器中35℃水浴振蕩48 h，過(guò)濾、離心、蒸發(fā)得到純植物提取液［10］。貼上標(biāo)簽備用。

1.3 植物提取液最小抑菌濃度的測(cè)定

吸取不同濃度的植物提取液于各個(gè)無(wú)菌平板中，分別與熱的培養(yǎng)基(46～48℃)混合均勻，得到7種含有體積濃度分別為0.1%，0.2%，0.5%的植物提取液的無(wú)菌平板。待凝固后在各個(gè)平板上用劃線法均勻地在4個(gè)不同區(qū)域分別接4種參試菌:大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌。在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h后，根據(jù)培養(yǎng)基上劃線處是否有明顯的細(xì)菌生長(zhǎng)的痕跡來(lái)判斷各種植物提取液的MIC值。含最低濃度香辛料提取液并且無(wú)菌生長(zhǎng)者，便為該香辛料對(duì)該參試菌的MIC［11］。

1.4 天然植物型抑菌劑的配制

本試驗(yàn)根據(jù)各個(gè)香辛料所測(cè)得的MIC選擇了除了豆蔻的其余6種具有較好抑菌效果的香辛料提取液進(jìn)行了抑菌劑的配制。配料及配料比參考專利:一種天然植物提取物的混合物及其制備方法和應(yīng)用［12］。分別將體積濃度為0.01%的6種香辛料乙醇提取液，0.1%的檸檬酸，0.05%的檸檬酸鈉，0.005%的EDTA，以及15%的乙醇加入無(wú)菌水中，搖勻，貼上標(biāo)簽備用。

1.5 天然植物型抑菌劑對(duì)6種致病菌的抗菌性能評(píng)價(jià)

在6支空試管里各加入10 mL天然植物型抑菌劑，再分別加入經(jīng)前培養(yǎng)的6種參試菌，使菌液濃度為106CUF/mL和107CFU/mL。另取6支分別加入10 mL磷酸鹽緩沖液［Phosphate-Buffered Saline，PBS，0.03 mol/L，pH(7.2 ～ 7.4)］的試管，同樣加入經(jīng)前培養(yǎng)的上述6種參試菌，作為對(duì)照［13］。在恒溫培養(yǎng)搖床中，35℃振蕩培養(yǎng)，同時(shí)分別在0，0.5，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)對(duì)各試管中活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.6 天然植物型抑菌劑的機(jī)理分析

分別取經(jīng)天然植物型抑菌劑作用前后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌樣品進(jìn)行透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)和掃描電鏡 (scanning electron microscopy，SEM)樣品制備，分別進(jìn)行電鏡觀察［14，15］。

1.7 天然植物型抑菌劑對(duì)草莓的保鮮效果分析

分別將表觀較一致的草莓放入4只保鮮盒中，其中兩盒噴灑配制的天然植物型抑菌劑，另兩盒噴灑無(wú)菌水蒸餾水作對(duì)照。將1盒對(duì)照組草莓和1盒試驗(yàn)組草莓放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中。另外1盒對(duì)照組草莓和1盒試驗(yàn)組草莓放入4℃的冰箱中冷藏。每天觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組的區(qū)別［16，17］。

2 結(jié)果分析

2.1 植物提取液MIC的測(cè)定

7種植物提取液對(duì)4種參試菌的MIC結(jié)果如表1所示。百里香、迷迭香、甘草、意大利蠟菊、貫葉連翹5種提取液對(duì)4種致病菌有明顯的抑菌效果，MIC均為0.5%。肉桂提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.2%，有較好的抑菌效果。而豆蔻的植物提取液的MIC均大于0.5%，抑菌作用并不明顯。

表1 7種植物提取液的MICTable 1 The MIC of the seven spices %

2.2 天然植物型抑菌劑對(duì)6種致病菌的抗菌性能評(píng)價(jià)

由圖1可知，所配制的天然植物型抑菌劑對(duì)6種致病菌均有明顯的殺菌作用。但相對(duì)而言，對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果更明顯。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，天然植物型抑菌劑對(duì)6種致病菌都具有顯著的抑菌效果，其殺菌率達(dá)到99.99%。

圖1 天然植物抑菌劑對(duì)6種致病菌的抑菌效果Figure 1 The viable cell counts after the disinfectant treatment

2.3 天然植物型抑菌劑的機(jī)理分析

由圖2、3可知，健康的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)菌形態(tài)完整，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)清晰，單個(gè)的細(xì)菌長(zhǎng)勢(shì)飽滿。但是經(jīng)過(guò)天然植物型抑菌劑處理的細(xì)菌其細(xì)胞膜被攻破，細(xì)菌結(jié)構(gòu)散亂，細(xì)胞質(zhì)流出，組織變質(zhì)。從透射電鏡圖和掃描電鏡圖可以看出:天然植物型抑菌劑中的抑菌物質(zhì)可以破壞細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞形態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，最終導(dǎo)致細(xì)胞完全破裂。

2.4 天然植物型抑菌劑對(duì)草莓的保鮮效果

圖2 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在天然植物型抑菌劑作用前后的TEM圖Figure 2 TEM images of S.aureus and E.coli before or after disinfectant treatment

圖3 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在天然植物型抑菌劑作用前后的SEM圖Figure 3 SEM images of S.aureus and E.coli before or after disinfectant treatment

草莓在常溫下保存7 d時(shí)，對(duì)照組草莓有明顯的菌落出現(xiàn)，并且有汁液流出，草莓有明顯的褐變腐爛現(xiàn)象。而噴灑了天然植物型抑菌劑的試驗(yàn)組草莓的顏色、氣味未發(fā)生大的改變。草莓在常溫下保存10 d時(shí)，對(duì)照組草莓已經(jīng)嚴(yán)重腐爛，看不出原型，并且有難聞的氣味。而噴灑了天然植物型抑菌劑的試驗(yàn)組草莓并無(wú)明顯的菌落產(chǎn)生，也沒(méi)有腐爛的跡象，僅有稍微的褐變現(xiàn)象。草莓在4℃冷藏的條件下時(shí)，噴灑了抑菌劑的試驗(yàn)組草莓在第10天時(shí)才有了一點(diǎn)褐變的現(xiàn)象，但無(wú)菌落產(chǎn)生，也沒(méi)有發(fā)生腐爛。而對(duì)照組草莓第5天就有了菌落的出現(xiàn)和氣味的改變。第10天時(shí)，對(duì)照組草莓出現(xiàn)明顯的褐變，有難聞的氣味，并且有汁液流出。通過(guò)對(duì)照可知，所配制的天然植物型抑菌劑能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，起到了防腐保鮮的作用，延長(zhǎng)了草莓的保鮮時(shí)間。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)豆蔻、肉桂、百里香、意大利蠟菊、貫葉連翹、甘草和迷迭香等7種香辛料進(jìn)行了無(wú)水乙醇提取，并對(duì)各種香辛料的提取液進(jìn)行了MIC的測(cè)定。根據(jù)測(cè)定的MIC挑選出了除豆蔻外的6種抗菌性能相對(duì)較好的香辛料，以這6種香辛料提取液為原材料根據(jù)配方配制了天然植物型抑菌劑，并對(duì)所配制的抑菌劑進(jìn)行了抗菌性能評(píng)價(jià)，同時(shí)還對(duì)天然植物型抑菌劑的機(jī)理進(jìn)行了分析。從試驗(yàn)結(jié)果可知，豆蔻的MIC大于0.5%，肉桂提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.2%，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌的MIC為0.5%。其余5種香辛料提取液對(duì)4種致病菌的MIC均為0.5%。由此可以明顯看到，除了豆蔻外，其余6種香辛料均具有較好的抑菌效果。配制的天然植物型抑菌劑，對(duì)6種致病菌均有明顯的抑菌效果，抑菌率可達(dá)到99.99%。從透射電鏡和掃描電鏡圖中可以看出，配制的抑菌劑可以破壞病原菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。最后，在天然植物型抑菌劑對(duì)草莓的保鮮試驗(yàn)中，天然植物型抑菌劑能有效地延長(zhǎng)草莓的保鮮時(shí)間，在第10天，噴灑了天然植物型抑菌劑的草莓才出現(xiàn)了質(zhì)地的變化。本試驗(yàn)證明了以香辛料提取液為原料所配制的抑菌劑有較好抗菌性能，與此同時(shí)還能發(fā)揮純天然，安全又綠色的優(yōu)勢(shì)，在食品保鮮領(lǐng)域擁有著廣闊的前景。

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