孫雪萍 楊家林 徐 艷 劉海娟 任 義

(1.廣西海洋研究所，廣西北海 536000;2.北海藝術(shù)設(shè)計職業(yè)學院環(huán)境藝術(shù)設(shè)計系，廣西 北海 536000)

方格星蟲(Sipunculus nudus)，俗稱沙蟲，屬于星蟲動物門，星蟲科，方格星蟲屬動物，在中國海域有廣闊的資源分布。據(jù)記載［1］，沙蟲性寒、味甘、咸，具有滋陰降火、清肺補虛、活血強身及補腎養(yǎng)顏等功能，可以治療骨蒸潮熱，陰虛盜汗、肺虛喘咳等多種病癥。近年來大量的研究［2#4］發(fā)現(xiàn)，天然來源的蛋白質(zhì)經(jīng)過酶促反應(yīng)水解后，得到的小肽具有多種生理功能，如抗氧化、抗菌、降血壓、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用?，F(xiàn)代研究［5#7］亦表明方格星蟲含有豐富的蛋白質(zhì)，多種氨基酸和微量元素，具有抗氧化、抗菌、抗輻射等多種生物活性。目前已有研究［8］表明，方格星蟲經(jīng)過生物酶解后獲得的酶解產(chǎn)物含有蛋白質(zhì)、多肽以及游離氨基酸等成分，并具有較強的抗氧化作用。本研究擬采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化采集自北海北部灣海域的方格星蟲的蛋白酶解工藝，旨在為方格星蟲的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

方格星蟲:采自廣西北海的廣西海洋研究所海水養(yǎng)殖示范基地的沙蟲養(yǎng)殖大塘，干燥后粉碎，過80目篩備用，凱氏定氮法測定蛋白含量為(69.3±5.41)%;

三硝基苯磺酸(TNBS)，美國Sigma公司;

胃蛋白酶(5萬U/g)、木瓜蛋白酶(9萬U/g)、堿性蛋白酶(55萬U/g)、復(fù)合蛋白酶(8萬U/g)、風味蛋白酶(3萬U/g)和中性蛋白酶(5萬U/g):諾維信生物技術(shù)有限公司;

胰蛋白酶:1萬U/g，廣西南寧東恒華道生物科技有限公司;

其余試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫浴鍋:DK-S26型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;

紫外可見分光光度計:TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司;

精密電子天平:ME104型，梅特勒—托利多儀器有限公司;

精密pH計:PB-10型，賽多利斯科學儀器有限公司;

氮磷鈣測定儀:NPCa-02型，上海洪紀儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水解用酶的篩選 取1.5 g方格星蟲蛋白粉，加入30 mL水，按照表1中7種蛋白水解酶最適宜酶解條件進行酶解，酶與底物比設(shè)定為5%，攪拌酶解4 h后，沸水滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。

表1 7種蛋白水解酶最適宜的反應(yīng)條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of seven proteases

1.2.2 水解度的測定 取水解上清液0.5 mL，加入 1%SDS 2.5 mL混合均勻。取混合液15 μL，依次加入1%SDS 35 μL，pH 8.2 磷酸緩沖溶液 1 000 μL，0.1% 三硝基苯磺酸(TNBS)500 μL?；靹蚝笾糜?0℃烘箱中避光反應(yīng)1 h后，加入0.1%HCl 2 mL終止反應(yīng)，室溫靜置30 min后，340 nm下測定吸光值。以賴氨酸為對照品制作標準曲線。按照式(1)、(2)計算水解度(degree of hydrolysis，DH)［9］。

式中:

DH——水解度，%;

C1——水解后的游離氨基濃度，mmol/mL;

C0——水解前的游離氨基濃度，mmol/mL;

P——總肽鍵濃度，mmol/mL。

式中:

Ch——水解液蛋白濃度，g/mL;

htot——底物中肽鍵總數(shù)，由氨基酸分析結(jié)果得到方格星蟲為 9.6 mmol/g。

1.2.3 單因素考察 在確定水解用酶的基礎(chǔ)上，考察了酶與底物比(Enzyme/Substrate，E/S)，酶解時間和酶解溫度3個因素對方格星蟲蛋白酶解效果的影響。

(1)酶與底物比對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照不同的酶與底物比(4%，5%，6%，7%，8%)，50℃攪拌酶解4 h后，開水煮沸10 min滅酶，4 000 r/min離心10 min，取上清液測定水解度。

(2)酶解時間對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S為7%，50℃攪拌酶解不同時間(2，3，4，5，6 h)，滅酶，離心后測定水解度。

(3)酶解溫度對水解度的影響:取方格星蟲蛋白1.5 g，加入30 mL水，按照E/S為7%，在不同酶解溫度下(40，45，50，55，60℃)攪拌酶解5 h后，滅酶，離心后測定水解度。

1.2.4 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計 在單因素試驗考察的基礎(chǔ)上，確定了E/S、酶解時間和酶解溫度3個因素的最適宜考察范圍。采用Design Expert 8.05軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以E/S、酶解時間和酶解溫度為自變量，以水解度為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗。

1.2.5 統(tǒng)計分析 重復(fù)3次試驗，結(jié)果取其平均值。采用Design Expert 8.05軟件對數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，包括顯著性差異分析、方差分析以及最佳試驗條件和最佳響應(yīng)值預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的篩選

由圖1可知，7種蛋白水解酶對方格星蟲蛋白水解效果相差較大。胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果較差。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風味蛋白酶和中性蛋白酶水解效果較好。復(fù)合蛋白酶的水解效果最佳，在相同的酶解條件下，水解度達到20.95%。因此選擇復(fù)合蛋白酶用于水解方格星蟲蛋白。

圖1 7種蛋白水解酶的水解效果Figure 1 The hydrolysis effects of seven different proteases

2.2 單因素考察

2.2.1 酶與底物比(E/S)對水解度的影響 由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著E/S的升高，水解度隨之升高。但當E/S超過7%，水解度出現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于酶濃度逐漸為底物所飽和的原因，因此選擇E/S為6% ～8%作為響應(yīng)面考察的范圍。

2.2.2 酶解時間對水解度的影響 由圖3可知，在2～5 h時，隨著酶解時間的延長，方格星蟲蛋白的水解度相應(yīng)地增加。當酶解時間超過5 h后，水解度有所下降。結(jié)果表明在5 h左右時蛋白基本水解達到平衡，因此選擇4～6 h作為考察范圍。

圖2 酶與底物比對水解度的影響Figure 2 Effects of E/S on DH

圖3 酶解時間對水解度的影響Figure 3 Effects of hydrolysis time on DH

2.2.3 酶解溫度對水解度的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的不斷升高，水解度呈現(xiàn)先上升而后下降的變化趨勢。在40～50℃時，水解度隨著酶解溫度的升高而升高。當酶解溫度超過50℃，水解度有所下降。雖然酶解溫度的升高能夠提高酶解反應(yīng)的速率，但是酶是一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，溫度過高會導(dǎo)致其部分失去催化活性，從而會減低酶促反應(yīng)速率，因此選擇45～55℃作為考察范圍。

2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計分析及結(jié)果

2.3.1 模型建立及顯著性差異分析 本研究在考察單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對方格星蟲蛋白的最優(yōu)酶解工藝進行優(yōu)化。試驗因素及水平取值見表2。利用Design-expert軟件對表3的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到對E/S、酶解時間和酶解溫度的二元多次回歸方程為:

圖4 酶解溫度對水解度的影響Figure 4 Effects of hydrolysis temperature on DH

表2 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 2 Factor and level of response surface experiment

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

由表4可知，模型二次項X1X2、X12和X32差異顯著。同時由P值可知，在E/S、酶解時間和酶解溫度3個因素中，酶解溫度對水解度的影響最大，其次為酶解時間和E/S。同時由方差分析結(jié)果可以看出，回歸模型的P值為0.015 9，表明回歸模型顯著。失擬項的P值為0.976 2，表明失擬誤差相對于純誤差是不顯著的，該模型具有較好的回歸系數(shù)(R2=0.879 9)，說明該試驗設(shè)計是合理穩(wěn)定的，能夠較好地描述試驗結(jié)果，使用回歸方程代替真實的試驗點進行方格星蟲蛋白酶解的分析和預(yù)測是可行的。

2.3.2 響應(yīng)面直觀分析 由圖5可知，酶與底物比和酶解時間對水解度的影響不大，在兩個因素的全值變化范圍內(nèi)，水解度隨酶與底物比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，隨著酶解時間的不斷延長，水解度趨于平穩(wěn)。由圖6可知，酶解溫度的變化對水解度的影響高于E/S，在兩個因素的全值變化范圍內(nèi)，水解度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，兩者的交互作用在圖形中反映出適宜的條件會使水解度到達最大值，但是過高或過低都會使水解度降低。由圖7可知，酶解時間和酶解溫度的相互作用呈現(xiàn)同樣的變化趨勢。

表4 響應(yīng)面分析方差分析表Table 4 Variance analysis of response surface design

圖5 酶與底物比與酶解時間的等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 5 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and enzymatic hydrolysis time

圖6 酶與底物比與酶解溫度的等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 6 Contour diagram and response surface plot of effects of E/S and hydrolysis temperature

圖7 酶解時間與酶解溫度的等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 7 Contour diagram and response surface plot of effects of enzymatic hydrolysis time and hydrolysis temperature

綜合以上單因素及響應(yīng)面分析試驗結(jié)果，使用Designexpert軟件，得到最佳的酶解條件為:E/S7.81%，酶解時間4 h，酶解溫度50.93℃，預(yù)期達到的水解度為23.76%?？紤]實際生產(chǎn)情況，最佳酶解條件修正為酶與底物比7.8%，酶解時間4 h，酶解溫度50℃。按照確定的最佳酶解條件進行酶解驗證實驗(n=3)，所得的實際水解度為(24.81±1.72)%，說明所建立的試驗?zāi)Ｐ湍軌蛘鎸嵎从橙蛩貙τ趶?fù)合蛋白酶酶解方格星蟲蛋白的影響，該酶解工藝可靠穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法，考察了酶與底物比、酶解時間和酶解溫度3個因素對方格星蟲蛋白水解的影響，經(jīng)過優(yōu)化得到最佳酶解條件，采用復(fù)合蛋白酶酶解，酶與底物比為7.8%，酶解時間為4 h，酶解溫度為50℃。在此條件下，水解度達到24.81%，說明該工藝穩(wěn)定可靠，對實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。大量研究［10#12］表明，生物活性肽是以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)中，通過適當?shù)拿附庾饔?，可以將潛在形式存在于蛋白質(zhì)的活性肽釋放出來，從而得到具有特殊生物學功能的活性肽。因此本研究可為后續(xù)方格星蟲蛋白的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)，同時方格星蟲蛋白酶解產(chǎn)物的生物活性有待于今后進一步的研究。

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