任 方，易 忠，米曉云，魏 婕，馬文戈，郭會玲，苗書魁，汪立群，王 延，薛 英，魏玉榮，黃 炯

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830063）

·研究論文·

環(huán)形泰勒蟲表面抗原重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1生物信息學分析與原核表達

任 方1,2，易 忠2，米曉云2，魏 婕2，馬文戈2，郭會玲2，苗書魁2，汪立群3，王 延2，薛 英2，魏玉榮2，黃 炯1,2

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830063）

運用生物信息學軟件對環(huán)形泰勒蟲表面抗原串聯(lián)基因Tasp-Tams1-Spag1進行分析，預測其編碼蛋白的主要特性與抗原表位等，并對此串聯(lián)基因進行克隆與原核表達。結果表明：串聯(lián)重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1屬于不穩(wěn)定非分泌型親水性蛋白；編碼346個氨基酸；有4個低復雜性的結構域，且含有Sorb與Btz、NL、NOT的同源區(qū)域；可能存在11個B細胞表位優(yōu)勢區(qū)段與17個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)段，含有T、B細胞聯(lián)合表位，表明Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白可能具有良好的免疫原性。IPTG誘導重組蛋白原核表達，結果顯示，該重組蛋白以包涵體形式存在；經(jīng)Western blot檢測，表明此串聯(lián)蛋白反應原性良好，為后續(xù)深入研究免疫抗原奠定基礎。

環(huán)形泰勒蟲；重組蛋白；原核表達；生物信息學

環(huán)形泰勒蟲病是由環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）寄生于動物紅細胞、淋巴細胞及巨噬細胞內引發(fā)的一種蜱傳急性、熱性血液原蟲病。此病呈地方流行性，表現(xiàn)為急性經(jīng)過，不僅發(fā)病率與死亡率較高，當病畜耐過此病或治愈后，體內仍存在低水平的蟲體，導致抵抗力下降，其他疾病爆發(fā)時可再次誘發(fā)此病[1,2]。環(huán)形泰勒蟲病對畜牧業(yè)危害很大，OIE將其列為B類疾病，我國列為二類疫病[3]。

裂殖子表面抗原（the merozoite surface antigen，Tams1）、裂殖體表面抗原（Theileria annulata surface protein, Tasp）及子孢子表面抗原（the sporozoite antigen, SPAG1）已被確認具有較好的免疫原性，可作為診斷與預防環(huán)形泰勒蟲病的理想候選疫苗[4]。但由于環(huán)形泰勒蟲存在表面抗原多態(tài)性，使得單一的表面抗原不能完全免疫預防此病。

本研究應用生物信息學方法分析此串聯(lián)表面蛋白的主要特性，推測其蛋白可能存在的抗原表位優(yōu)勢區(qū)段，發(fā)現(xiàn)Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白具有良好的免疫原性。在此基礎上構建含環(huán)形泰勒蟲表面抗原串聯(lián)基因Tasp-Tams1-Spag1的原核表達載體，進行串聯(lián)蛋白的原核表達，為后續(xù)免疫抗原的研制奠定基礎。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及細胞 質粒pMD-Tasp-Tams1-Spag1、pET-28a原核表達質粒與BL21（DE3）表達宿主菌由新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所傳染病研究室保存；pEASY-T1載體與Trans1-T1感受態(tài)細胞為北京全式金公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 DNA聚合酶、2.5 mmol/L的dNTP mixture、10×Buffer（Mg2+plus）為大連TaKaRa產(chǎn)品；限制性內切酶BamH I和XhoI為Promega公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶為BioLabs公司產(chǎn)品；小量質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；4×SDS雙色加樣緩沖液為武漢博士德生物公司產(chǎn)品；牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所提供；HRP標記的兔抗牛IgG為SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 串聯(lián)重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1生物信息學分析 運用在線軟件Expasy將核苷酸序列翻譯成蛋白質序列后分析蛋白的分子質量、等電點、平均親水系數(shù)等理化性質，并推測出蛋白的跨膜區(qū)、信號肽與蛋白的二級結構等；運用生物學軟件DNAStar分析蛋白的柔韌性、表面可及性與親水性；使用在線軟件SMART分析蛋白的結構功能域；運用 COMPLUTENSE、ABCpred與DNAMAN、SYFPEITHI、NetMHC等軟件綜合分析預測蛋白潛在的B細胞表位與T細胞表位。

1.2.2 引物的設計與合成 根據(jù)質粒p M DTasp-Tams1-Spag1序列，Oligo 6軟件設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。TSF：5'-AATGGATCCATGGAAGA TCAACAGCCTTTG-3'；TSR：5'-AACCTCGAG TTAGAGTTTGTTTTTGATCTTTTG-3'，其中下劃線堿基為BamH I和Xho I酶切位點。

1.2.3 基因片段PCR擴增 以質粒pMD-Tasp-Tams1-Spag1為模板，擴增Tasp-Tams1-Spag1基因片段，PCR反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×Buffer（Mg2+plus）、4 μL 2.5 mmol/L dNTPs、20 μmol/mL上下游引物各1 μL、0.3 μL模板DNA、0.25 μL 5U/μL TaqHS，15.95 μL ddH2O。擴增反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性 45 s，53.4 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止反應。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收純化。

1.2.4 PEASY-T1-Tasp-Tams1-Spag1載體的構建回收純化的PCR產(chǎn)物與PEASY-T1載體連接，按試劑盒說明操作后轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中。挑取陽性菌落質粒提取，命名為pEASY-T1-Tasp-Tams1-Spag1。

1.2.5 BL21（DE3）感受態(tài)細胞的制備 以CaCl2法制備 BL21（DE3）感受態(tài)細胞，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 重組表達載體的構建與鑒定 將pEASY-T1-Tasp-Tams1-Spag1重組質粒與原核表達載體pET-28a，同時用BamH I和Xho I進行雙酶切，回收目的片段后在T4 DNA連接酶作用下連接，將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞DH5α中。獲得的重組質粒pET-28a-Tasp-Tams1-Spag1經(jīng)雙酶切后測序鑒定。

1.2.7 重組質粒的誘導表達 挑取鑒定正確的陽性轉化菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基（kana+）中，37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的體積比將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（kana+），37℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.8時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，誘導表達4 h。2300×g離心5 min，收集菌體，加入滅菌PBS緩沖液（pH=7.4）充分懸浮，經(jīng)處理后進行12% SDS-PAGE電泳檢測分析，確認目的蛋白是否表達。

1.2.8 重組表達蛋白的可溶性檢測 按常規(guī)方法在OD600為0.4～0.8時加入IPTG至終濃度為1 mmol/ L，室溫條件下過夜誘導后，進行超聲破碎，13 500×g 4 ℃離心15 min，分別收集上清液和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳檢測分析。

1.2.9 重組表達蛋白Western blot的檢測 將表達的蛋白轉至NC膜后，用含5%脫脂牛奶的PBST于4℃封閉過夜，以牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清（1∶100）為一抗，孵育2 h，PBST緩沖液洗膜后，以HPR標記的兔抗牛IgG為二抗，孵育1h，用PBST緩沖液洗滌后進行DAB顯色后拍照保存。

2 結果

2.1 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1的生物信息學分析結果

2.1.1 Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白的基本特性Expasy分析得出Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白基因編碼氨基酸346 個，分子量37.36 kDa，等電點理論值為4.46，波長280 nm時的吸光度（A）值為0.494，半衰期為30 h，平均親水系數(shù)為-0.862，不穩(wěn)定系數(shù)為51.02，歸類為親水性不穩(wěn)定蛋白。

DNAStar軟件分析顯示此重組蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，可以形成豐富的二級結構（圖1），絕大部分區(qū)段位于蛋白質表面即蛋白親水區(qū)域（圖2），表明位于蛋白質表面的可及性區(qū)域都有作為 B 細胞表位優(yōu)勢區(qū)域的潛能。

Expasy預測出Tasp-Tams1-Spag1蛋白存在3個疏水區(qū)域，具體位置為aa150～160，aa217～248及aa277～284，從整體來看整個多肽鏈分值大部分都小于0，說明此蛋白屬親水性（圖3）。

圖1 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1柔韌性區(qū)域分析Fig.1 Analysis of the fl exible region of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

圖2 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1表面可及性、親水性分析Fig.2 Analysis of the surface accessibility and hydrophilicity of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

圖3 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1疏水性分析Fig.3 Analysis of the hydrophobicity of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

TMPRED分析Tasp-Tams1-Spag1蛋白存在2個可能的跨膜區(qū)，一個跨膜螺旋從內部穿出細胞，長度從第 222個氨基酸至第 241 個氨基酸，一個跨膜螺旋從外部穿入內部，長度從第 220 個氨基酸至第 237 個氨基酸，但該段蛋白序列中并不存在信號肽，屬于非分泌型蛋白。

2.1.2 Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白二級結構的預測 DNAstar軟件預測該重組蛋白的二級結構，并運用SOPMA在線軟件做進一步分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1可能存在83個螺旋（總長的23.99%），228個無規(guī)則卷曲（占65.90%），35個延伸鏈（占10.12%）（圖4）。

圖4 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1二級結構預測Fig.4 Secondary structure prediction of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

2.1.3 Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白結構功能域分析 SMART 分析重組蛋白結構功能域，得知Tasp-Tams1-Spag1蛋白的aa28～83、aa110～130、aa238～252位及aa305～338為低復雜性的結構域，且aa81～120之間含有Sorb同源區(qū)域，aa95～201之間含有Btz同源區(qū)域，aa96～121之間含有NL同源區(qū)域，aa134～245之間含有NOT的結構域。

2.1.4 Tasp-Tams1-Spag1重組蛋白抗原表位的預測抗原表位又稱抗原決定簇（antigenic determinant，AD)，其數(shù)目、性質與空間構型決定抗原的特異性。應用Jameson-Wolf抗原指數(shù)，綜合蛋白二級結構、鏈柔韌性、疏水區(qū)域等預測B細胞表位，結合ABCpred、Bepipred及COMPLUTENSE等軟件預測重組蛋白可能具有11個B細胞抗原表位優(yōu)勢區(qū)域（圖5和表1）。

SYFPEITHI預測重組蛋白的T細胞表位，預測分值大于16的肽段被認為能與MHC I類分子結合。綜合軟件NetMHC預測的共同區(qū)域，推測出此重組蛋白可能存在17個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)域（表2）。

綜合重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1的T、B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域，預測T、B細胞聯(lián)合表位可能的區(qū)域為aa211～220（KPVVDKFSPL)、aa291～300（VTPTQPSNLP）。

圖5 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1抗原表位分析Fig.5 Analysis of the antigenic epitopes of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

表1 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1的B細胞抗原表位Table1 The B-cell epitopes of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

表2 重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1的T細胞抗原表位Table2 The T-cell epitopes of the recombinant protein Tasp-Tams1-Spag1

2.2 Tasp-Tams1-Spag1基因的PCR擴增及其原核表達質粒的構建與鑒定以質粒pMD-Tasp-Tams1-Spag1為模板進行PCR擴增，獲得與預期相符的長約1041 bp的目的條帶（圖6A）。將構建好的重組質粒pET-28a-Tasp-Tams1-Spag1經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切，得到長約1041 bp的基因片段與5369 bp的pET-28a載體片段（圖6B），大小與理論值相符。

圖6 Tasp-Tams1-Spag1基因的PCR擴增結果（A）及原核表達質粒的酶切鑒定（B）Fig.6 PCR results of Tasp-Tams1-Spag1 gene(A) and identifi cation of recombinant plasmid by enzyme digestion(B)

2.3 原核重組質粒的誘導表達對重組質粒誘導表達進行SDS-PAGE電泳檢測分析，與對照組相比，在35～40 kDa處存在一條特異性的蛋白條帶，與預期大小一致，而對照組未出現(xiàn)此表達條帶（圖7）。

圖7 重組質粒的誘導表達Fig.7 IPTG-induced expression of the recombinant plasmid

2.4 重組表達蛋白的可溶性檢測對樣品進行SDSPAGE電泳檢測分析，結果顯示，重組表達蛋白主要以包涵體形存在（圖8）。

圖8 重組蛋白的可溶性檢測Fig.8 Solubility test of the recombinant protein

2.5 重組表達蛋白Western blot的檢測用牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清抗體進行Western blot，在35～40 kDa處出現(xiàn)特異性雜交條帶，而對照的表達產(chǎn)物則無此條帶（圖9），可以初步確定重組蛋白大量表達且反應原性良好。

圖9 重組蛋白的Western blot檢測Fig.9 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

在動物體的免疫應答中，抗原表位被相應的特異性抗原受體識別，從而激發(fā)機體特異性免疫。特異性免疫包括由B細胞介導的體液免疫和由T細胞介導的細胞免疫[5]。根據(jù)其T細胞與B細胞抗原表位，研究表位疫苗與高效的診斷試劑是當前的熱點。運用生物信息學方法預測抗原表位，并通過對這些抗原表位進行分析，推測抗原表位肽段的免疫原性從而有效的指導實驗的進行，是目前研究診斷試劑與表位疫苗的有效方法。

裂殖子表面抗原（Tams1）是環(huán)形泰勒蟲感染紅細胞時表面分泌的一種膜內蛋白，免疫原性很好。2008年，黃家雨等[6]以新疆牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因為基礎成功建立了巢式PCR診斷方法。近年來在國外，以Tam1基因為引物建立的PCR技術已運用于環(huán)形泰勒蟲病的診斷中[7]。子孢子表面抗原（SPAG1）是蟲體發(fā)育至子孢子階段時分泌的一種膜內蛋白，具有較好的免疫原性。在國外，學者們已經(jīng)陸續(xù)以 SPAG1 重組抗原建立了環(huán)形泰勒蟲的ELISA 的檢測方法。當蟲體感染宿主時，產(chǎn)生的抗裂殖體表面抗原（TaSP）的抗體同樣具有良好的免疫原性，可以作為診斷環(huán)形泰勒蟲病的理想抗原[8-10]。Mohamed等[11]對Tasp作為ELISA抗原檢測環(huán)形泰勒蟲病進行了評估，證實了此方法的可靠性。雖然上述三種表面抗原的免疫原性均已被驗證并在實際診斷中應用，但以單一抗原為基礎的診斷方法還存在著一些問題，例如抗原多態(tài)性的存在，各分離株間變異性的出現(xiàn)，不完全保護的產(chǎn)生等[12]。而對環(huán)形泰勒焦蟲不同發(fā)育階段的串聯(lián)表面優(yōu)勢抗原蛋白的研究則解決了這些問題，為篩選理想的候選抗原提供了一條新的思路。

本研究對串聯(lián)重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1的基本特性、二級結構、親水性、表面可及性、柔韌性等參數(shù)進行預測，同時綜合推測其B細胞可能存在的表位。串聯(lián)重組蛋白Tasp擁有346個氨基酸，屬于不穩(wěn)定非分泌型親水性蛋白。在蛋白的aa28～83、aa110-130、aa238-252、aa305-338為低復雜性的結構域，且蛋白在aa81～120含有Sorb同源區(qū)域，在aa95～201含有Btz同源區(qū)域，在aa96～121含有NL同源區(qū)域，在aa134～245含有NOT的結構域。串聯(lián)重組蛋白Tasp可能含有11個B細胞表位優(yōu)勢區(qū)段與17個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)段，推測含有兩段交叉反應性表位肽，分別可能存在的區(qū)域為aa211～220（KPVVDKFSPL）、aa291～300（VTPTQPSNLP）。在理論方面證實Tasp-Tams1-Spag1串聯(lián)重組蛋白具有很好的免疫原性，適合作為理想的診斷試劑與表位疫苗。本研究依此為基礎克隆了Tasp-Tams1-Spag1串聯(lián)基因，并成功表達出串聯(lián)重組蛋白，經(jīng)Western blot的檢測表明其可被環(huán)形泰勒蟲陽性血清識別。在理論與實踐方面均表明該串聯(lián)重組蛋白具有很好的反應原性，為后續(xù)免疫抗原的研制提供了基礎，并為進一步研究環(huán)形泰勒蟲抗原串聯(lián)蛋白提供借鑒。

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BIOINFORMATICS ANALYSIS PROKARYOTIC EXPRESSION OF RECOMBINANT SURFACE ANTIGEN TASP-TAMS1-SPAG1 OF THEILERIA ANNULATA

REN Fang1,2, YI Zhong2, MI Xiao-yun2, WEI Jie2, MA Wen-ge2, GUO Hui-ling2, MIAO Shu-kui2, WANG Li-qun3, WANG Yan2, XUE Ying2, WEI Yu-rong2, HUANG Jiong2

(1.College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2.Institute of Veterinary Medicine, Animal Science Academy of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, China; 3.Institute of Animal Health Inspection of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830063, China;)

Theileria annulata; recombinant protein; prokaryotic expression; bioinformatics

: The main characters and antigenic epitopes of the recombinant protein Tasp-tams1-spag of Theileria annulata were analyzed and predicted in the present study by using the biological software and online software in order to clone the surface antigen Tasp-tams1-spag gene and to construct prokaryotic expression vectors.The recombinant Tasp-tams1-spag contained 346 amino acids and belonged to unstable hydrophilic non-secreted protein.It contained 4 low complexity domains as well as Sorb, Btz, NL and NOT homologous regions.There might be 11 B-cell major epitope domains, 17 T-cell major epitope domains and two cross-reactive epitopes.The recombinant protein was predicted to have good immunogenicity in theory.Subsequently, the recombinant Tasp-tams1-spag was expressed byinduction with IPTG and expression condition was optimized.The expressed protein was mainly obtained in the form of inclusion bodies.Western blot assay also revealed that the recombinant protein had good antigenicity.

2014-12-02

國家自然科學基金項目（31160505）；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項（201103008）

任方，女，碩士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

魏玉榮，E-mail：jh124@163.com；黃炯，E-mail：weiyu1113@sina.com

S852.723

A

1674-6422（2015）02-0060-08