李 莎，梁思婷,2，趙其平，韓紅玉，朱順海，翟 頎，楊斯涵,3，黃 兵,4，董 輝

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；4.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶單克隆抗體的制備及其在蛋白定位中的應(yīng)用

李 莎1，梁思婷1,2，趙其平1，韓紅玉1，朱順海1，翟 頎1，楊斯涵1,3，黃 兵1,4，董 輝1

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；4.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

為了制備柔嫩艾美耳球蟲(chóng)乳酸脫氫酶（Eimeria tenella lactate dehydrogenase, EtLDH）單克隆抗體，用大腸桿菌表達(dá)的重組EtLDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)5次免疫后取脾臟制備免疫脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌EtLDH單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2F7和2H4，抗體亞類鑒定均為IgG1，腹水效價(jià)分別為1:8000和1:64 000。Western blot結(jié)果顯示2F7抗體能識(shí)別柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子中大小約為35 kDa的天然蛋白。利用該單抗對(duì)EtLDH在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子中的分布進(jìn)行了定位，結(jié)果顯示該蛋白主要分布于裂殖子的細(xì)胞質(zhì)，表明成功地制備了EtLDH 單克隆抗體，為深入研究EtLDH的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)；乳酸脫氫酶；單克隆抗體；免疫熒光定位

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella, Et）是隸屬于頂復(fù)器門（Apicomplexa）艾美耳屬的一種胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，蟲(chóng)體寄生在雞盲腸內(nèi)，可引起急性盲腸球蟲(chóng)病，主要臨診表現(xiàn)為精神萎頓，排血便，食欲下降，痙攣等癥狀，嚴(yán)重者可致死亡[1]。目前球蟲(chóng)病的控制主要依賴抗球蟲(chóng)藥物預(yù)防，但球蟲(chóng)幾乎對(duì)所有使用過(guò)的抗球蟲(chóng)藥物都已產(chǎn)生耐藥性[2]，迫切需要尋求新的藥物靶標(biāo)來(lái)合成新型抗球蟲(chóng)藥。通過(guò)尋找具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)并在球蟲(chóng)生活史中有重要作用的酶類[3, 4]，應(yīng)用其特異性設(shè)計(jì)特異的抑制劑作用于寄生蟲(chóng)蛋白，從而可達(dá)到控制雞球蟲(chóng)病的目的[5]。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是糖酵解途徑的末端酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng)，大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲(chóng)依靠此途徑獲取能量維持生存[6]。各種寄生蟲(chóng)LDH在理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)方面均有獨(dú)特的特性，是良好的診斷分子和潛在的藥物作用靶標(biāo)。在頂復(fù)器門原蟲(chóng)中，LDH 研究主要集中在瘧原蟲(chóng)[7-9]和弓形蟲(chóng)[10-12]中。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中對(duì)EtLDH基因特性進(jìn)行了初步研究[13]，本研究以原核表達(dá)的重組EtLDH （rEtLDH）蛋白免疫小鼠，制備了2株EtLDH的特異性McAb，并對(duì)EtLDH在蟲(chóng)體上的分布進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株和菌株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)上海株、含表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-EtLDH的大腸桿菌BL21均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞系6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑及試劑盒胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；HRP-羊抗鼠IgG、Protein G Agarose購(gòu)自碧云天公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、HAT、HT、DMSO、PEG-2000、降植烷、Texas RedR-羊抗鼠IgG等購(gòu)自Sigma公司；鼠源McAb亞類鑒定試劑盒購(gòu)自洛陽(yáng)賽爾維生物器材有限公司；Donkey-anti-Mouse IRDyeR660RD購(gòu)自O(shè)DDYSSEY公司。

1.4 抗原制備與動(dòng)物免疫將保存于-70℃的pET28a(+)-EtLDH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6，加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，離心收集菌體沉淀，冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞，離心收集上清，經(jīng)Ni-NTA純化可溶性蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果后，剩余的蛋白用BCA法測(cè)定蛋白濃度[13]。

將rEtLDH與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，按100 μg/只皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠。此后每隔2周將rEtLDH與弗氏不完全佐劑乳化，100 μg/只皮下多點(diǎn)注射以加強(qiáng)免疫，共免疫3次。融合前3 d用不加佐劑的rEtLDH（100 μg/只）腹腔注射1次進(jìn)行沖擊免疫。

1.5 細(xì)胞融合與篩選依據(jù)王建科[14]所述方法略作修改。無(wú)菌摘取免疫小鼠脾臟按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，37℃、5%CO2濃度條件下培養(yǎng)，5 d后用HAT培養(yǎng)基半量換液，7～10 d后換HT培養(yǎng)基。同時(shí)，以rEtLDH（含His融合蛋白標(biāo)簽）、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子蛋白和His蛋白分別包被96孔板。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至1/3～1/2孔底面積時(shí)，取上清液用間接ELISA方法檢測(cè)，并以免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，健康小鼠血清作為陰性對(duì)照。以能與rEtLDH和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子蛋白反應(yīng)（OD450＞0.5）而不與His蛋白反應(yīng)（OD450＜0.1），且P/N＞2.1（P為陽(yáng)性對(duì)照OD值，N為陰性對(duì)照OD值）時(shí)的克隆判為陽(yáng)性。對(duì)經(jīng)2次檢測(cè)均呈陽(yáng)性的孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，同時(shí)用有限稀釋法亞克隆，直到陽(yáng)性克隆率達(dá)100%時(shí)，方可確定建株。

1.6 腹水制備與McAb純化取6周齡BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌降植烷0.5 mL/只，7 d后每只腹腔注射DMEM培養(yǎng)基懸浮的雜交瘤細(xì)胞懸液0.5 mL（約含5×106個(gè)細(xì)胞），10 d后無(wú)菌采集腹水，10 800×g離心10 min，取上清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)用Protein G免疫親和層析柱進(jìn)行純化，SDS-PAGE檢測(cè)純化效果，過(guò)濾除菌后分裝，置于-70℃冰箱保存。

1.7 單克隆抗體相關(guān)特性的測(cè)定

1.7.1 亞類鑒定 按照McAb亞類鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行亞類鑒定。

1.7.2 效價(jià)測(cè)定 參照張花景[15]的方法。將rEtLDH和McAb分別稀釋成一系列的濃度梯度，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照，用方陣滴定法確立抗原抗體最佳工作濃度，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)角線位置選取OD450值接近1.0左右的孔，其對(duì)應(yīng)的rEtLDH包被濃度和McAb最大稀釋度分別作為抗原最佳包被濃度和McAb效價(jià)。

1.7.3 Western blot鑒定 分別取柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子蛋白和His蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的PBS懸液于4℃封閉過(guò)夜后，1∶1 000稀釋的McAb作為一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；Donkey anti-Mouse IRDyeR660RD作為二抗，以1∶10 000稀釋，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗5次，用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.8 EtLDH在第二代裂殖子的分布

1.8.1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子的制備 參照劉立恒等[16]的方法。將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊接種2周齡無(wú)球蟲(chóng)雞，感染后120 h剖殺取盲腸，滅菌PBS清洗盲腸后剪碎，經(jīng)酶消化液充分消化后過(guò)濾離心，用紅細(xì)胞裂解液充分裂解，然后用Percoll密度梯度離心法純化第二代裂殖子。

1.8.2 EtLDH的免疫熒光定位 將裂殖子懸液滴于蓋玻片上，自然風(fēng)干，加2%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次；加1% Triton-X-100室溫放置15 min，PBS洗3次；用含2% BSA的PBS封閉20 min，PBS洗3次；加McAb（200倍稀釋），37℃孵育l h，PBS洗3次，同時(shí)設(shè)置陰性鼠血清對(duì)照組；加TexasRRed-羊抗鼠IgG（1000倍稀釋），37℃避光孵育l h，PBS洗5次，并在PBS中避光浸泡30 min；加DAPI室溫放置30 min，PBS洗3次；加抗熒光淬滅劑，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立融合后d7雜交克隆的融合率為90%，經(jīng)2次ELISA篩選共得到18孔分泌抗體的陽(yáng)性克隆，再通過(guò)3次亞克隆篩選出2株穩(wěn)定分泌EtLDH McAb的強(qiáng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，分別命名為2F7 和2H4，經(jīng)多次傳代擴(kuò)大培養(yǎng)后雜交瘤細(xì)胞分泌抗體仍然穩(wěn)定，液氮凍存，經(jīng)復(fù)蘇后測(cè)定細(xì)胞仍保持分泌抗體的能力。

2.2 McAb亞類鑒定與效價(jià)測(cè)定McAb亞類鑒定結(jié)果顯示，2株McAb均為IgG1。2F7和2H4分泌McAb的最佳抗原包被濃度分別為12 μg/mL與8 μg/mL，效價(jià)分別為1∶8000與1∶64 000。

2.3 McAb的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定純化后的2株McAb經(jīng)SDS-PAGE均顯示出大、小2條主帶，分子量分別約為50 kDa（重鏈）和25 kDa（輕鏈）（圖1）。Western blot結(jié)果顯示，2F7能識(shí)別柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子約35 kDa大小的天然目的蛋白（圖2），而2H4卻不能識(shí)別蟲(chóng)體蛋白（圖片略）。

2.4 EtLDH在第二代裂殖子中的定位間接熒光定位結(jié)果顯示，2株McAb均能使裂殖子產(chǎn)生特異性熒光，熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖3）。

3 討論

McAb是由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，相比多克隆抗體，McAb具有無(wú)限量生產(chǎn)、高度的特異性和均一性等優(yōu)點(diǎn)。球蟲(chóng)McAb的研究始于20世紀(jì)末，至今已制備了抗球蟲(chóng)特異性階段蟲(chóng)體單抗（如子孢子[17]、裂殖子[18]）、細(xì)胞器單抗（如頂復(fù)合器[19]、折光體[20]）、蛋白單抗（如天冬氨酰蛋白酶[21]、棒狀體蛋白A08[22]）。McAb技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于球蟲(chóng)新基因和新抗原篩選、發(fā)育過(guò)程與致病機(jī)理探索、疾病診斷和預(yù)防治療等方面的研究，是球蟲(chóng)研究領(lǐng)域一種十分重要的工具[23]。

制備McAb的關(guān)鍵是有足量純凈的抗原[23]。常用的免疫原是以大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是抗原的獲得簡(jiǎn)單、方便，但在重組蛋白中含有標(biāo)簽序列，大的標(biāo)簽序列必須予以切割，否則可能會(huì)干擾目的雜交瘤細(xì)胞的篩選[24]。本研究首次利用重組表達(dá)的EtLDH蛋白免疫小鼠制備了單抗，所用的表達(dá)載體為pET28a（+），該質(zhì)粒含有的His標(biāo)簽只有6個(gè)組氨酸大小，在pH8.0時(shí)不帶電荷，分子量很小，幾乎沒(méi)有什么免疫原性，對(duì)蛋白的分泌、折疊、結(jié)構(gòu)甚至功能幾乎沒(méi)影響，所以無(wú)需切除[24]。單抗的制備需要進(jìn)行多層次的篩選，本研究中分別以蟲(chóng)體抗原、重組蛋白和His標(biāo)簽作為包被抗原進(jìn)行檢測(cè)，以減少假陽(yáng)性、標(biāo)簽干擾等問(wèn)題。

圖l 純化后單克隆抗體2F7和2H4的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purifi ed McAb 2F7 and 2H4

圖2 單克隆抗體2F7的Western blot鑒定Fig.2 Identifi cation of McAb 2F7 by Western blot

圖3 間接免疫熒光法檢測(cè)EtLDH在第二代裂殖子的分布Fig.3 The distribution of EtLDH in second-generation merozoites by IFA

本研究所獲得的2F7和2H4，亞型均為IgG1，腹水效價(jià)分別為1∶8000和1∶64 000。而同為頂復(fù)器門的惡性瘧原蟲(chóng) LDH McAb腹水效價(jià)為1∶6400～1∶51 200，亞類為IgG1/IgG2[25, 26]。間日瘧原蟲(chóng)LDH的McAb腹水效價(jià)為1∶12 800～1∶25 600，亞類為IgG1[27]。2F7能識(shí)別蟲(chóng)體的天然蛋白，而2H4不能，推測(cè)前者識(shí)別的是EtLDH的線性表位，而后者識(shí)別的是構(gòu)象表位。在Western blot中，抗原因變性而構(gòu)象表位遭到破壞，因此不適于檢測(cè)識(shí)別構(gòu)象表位的McAb。王建科[14]制備的8株水貂腸炎細(xì)小病毒的McAb均能用于間接免疫熒光檢測(cè)，但僅有5株能用于Western blot檢測(cè)。孫莉等[27]制備的5株間日瘧原蟲(chóng)LDH的McAb均能識(shí)別重組蛋白，但只有2株能識(shí)別蟲(chóng)體天然蛋白。有關(guān)EtLDH McAb識(shí)別抗原表位的鑒定尚需進(jìn)一步研究。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體的純度、抗原特異性和效價(jià)都有要求，純度不高、特異性不好的抗體會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，效價(jià)低則成像不清晰[28]。Dong等[29]用EtLDH多抗作為一抗，熒光定位結(jié)果顯示EtLDH分布于第二代裂殖子整個(gè)蟲(chóng)體的細(xì)胞質(zhì)，且EtLDH蛋白表達(dá)水平在第二代裂殖子階段最高。本研究用制備的2F7和2H4兩株McAb對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)第二代裂殖子進(jìn)行免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)與前者相比，McAb的特異性和親和性更好，無(wú)非特異性熒光，更適于EtLDH的定位和蟲(chóng)體檢測(cè)。

本研究成功制備了EtLDH的McAb，為后續(xù)用免疫共沉淀技術(shù)篩選相互作用蛋白，以及從球蟲(chóng)cDNA文庫(kù)或噬菌體展示文庫(kù)中分離鑒定功能基因等奠定了基礎(chǔ)。

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GENERATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST LACTATE DEHYDROGENASE OF EIMERIA TENELLA AND ITS APPLICATION IN PROTEIN LOCALIZATION

LI Sha1, LIANG Si-ting1, 2, ZHAO Qi-ping1, HAN Hong-yu1, ZHU Shun-hai1, ZHAI Qi1, YANG Si-han1, 3, HUANG Bing1, 4, DONG Hui1

(1.Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

Eimeria tenella; lactate dehydrogenase; monoclonal antibody; immunofl uorescent localization

: In order to prepare specifi c monoclonal antibodies (McAbs) against lactate dehydrogenase of Eimeria tenella (EtLDH), BALB/ c mice were immunized fi ve times with the recombinant fusion protein expressed in E.coli.Murine myeloma cells were fused with the splenocytes of the immunized mice.An indirect ELISA was used to screen antibody-producing hybridomas.After subcloned three times, two hybridoma clones 2F7 and 2H4 that secreted specifi c McAbs against EtLDH were obtained.Both belonged to IgG1 isotype.The ELISA titer of murine ascites from 2F7 and 2H4 was l:8000 and l:64 000, respectively.Western blot analysis indicated that a 35 kDanative protein of the second-generation merozoites of E.tenella was recognized by 2F7 McAb.The distribution of EtLDH in the secondgeneration merozoites of E.tenella was investigated through immunofl uorescent technique using both McAbs.The results indicated that LDH was distributed in the cytoplasm of the second-generation merozoites.The generation of these two McAbs will be useful to further study the function and characteristics of EtLDH.

2014-12-08

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272557）

李莎，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

董輝，E-mail∶ donghui@shvri.ac.cn

S852.723

A

1674-6422（2015）02-0047-06